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FDA是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(U.S.Food&Drug Administration)的簡(jiǎn)稱(chēng)，是美國(guó)食品與藥品管理的最高執(zhí)法機(jī)關(guān)，世界各國(guó)都會(huì)在一定程度上參考或依據(jù)FDA的相關(guān)法規(guī)來(lái)評(píng)估本國(guó)食藥類(lèi)產(chǎn)品的安全。 FDA召回則是一種對(duì)于不合格產(chǎn)品采取的撤回彌補(bǔ)行為，被召回的產(chǎn)品大致分為以下幾類(lèi)：食品（包括個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品）、藥品、生物制劑、設(shè)備、獸藥。 今天小編將對(duì)2013-2019年FDA藥品召回事件中，涉及微生物污染的召回事件進(jìn)行一個(gè)簡(jiǎn)單的回顧性分析。 微生物相關(guān)的召回事件占總事件的比例變化 2013-2019年藥物召回共有2327起，其中共有401起召回涉及微生物，占藥品召回總數(shù)的17.23%。涉及微生物的召回藥品中，無(wú)菌產(chǎn)品284起，非無(wú)菌產(chǎn)品117起。其中大部分的召回原因是缺乏無(wú)菌保證，有267起。 在微生物相關(guān)的召回事件中的無(wú)菌產(chǎn)品和非無(wú)菌產(chǎn)品的召回次數(shù) 在非無(wú)菌產(chǎn)品是指可以接受微生物存在的產(chǎn)品，但是產(chǎn)品中的微生物數(shù)量不能超過(guò)一定限度（微生物數(shù)量超限表明產(chǎn)品的生產(chǎn)環(huán)境或生產(chǎn)過(guò)程可能不受控）且不得檢出法規(guī)明確規(guī)定的控制菌以及“不可接受微生物”。 在117起非無(wú)菌產(chǎn)品的召回中，55起召回并未注明具體的污染微生物物種；在注明污染物種的召回中，真菌（酵母/霉菌）和細(xì)菌污染分別占19%和32%。而細(xì)菌污染中占比最大的污染菌為Burkholderia cepacia complex（洋蔥伯克霍爾德復(fù)合體），比例達(dá)到30.67%。其他曾在非無(wú)菌產(chǎn)品召回中出現(xiàn)過(guò)的細(xì)菌有：Escherichia. coli（大腸埃希氏菌）、Pseudomonas sp.（假單胞菌屬）、Sphingomonas paucimobilis（少動(dòng)鞘氨醇單胞菌）、Serratia liquefaciens（液化沙雷氏菌）、Staphylococcus warneri（沃氏葡萄球菌）、Staphylococcus aureus（金黃色葡萄球菌）、Klebsiella pneumoniae（肺炎克雷伯氏菌）、Bacillus circulans（環(huán)狀芽孢桿菌）、Variovorax paradoxus（爭(zhēng)論貪噬菌）、Pseudomonas aeruginosa（銅綠假單胞菌）等。 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物相關(guān)召回中污染菌的類(lèi)型 非無(wú)菌藥品微生物污染召回的相關(guān)法規(guī) 在《中國(guó)藥典》2015版第四部和美國(guó)藥典《USP》中，都有非無(wú)菌藥品在微生物檢查方面的相關(guān)規(guī)定，例如在“非無(wú)菌藥品的微生物限度檢查”中，明確根據(jù)給藥途徑規(guī)定了一些控制菌，其中包括大腸埃希菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌等；另外，對(duì)于藥品中的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)也有相關(guān)的規(guī)定。 在本次統(tǒng)計(jì)的FDA召回的非無(wú)菌產(chǎn)品中，Burkholderia cepacia complex（洋蔥伯克霍爾德復(fù)合體）污染是涉及召回次數(shù)最多的微生物，在2004~2011年的非無(wú)菌產(chǎn)品匯總中，Burkholderia cepacia complex（洋蔥伯克霍爾德復(fù)合體）也是召回產(chǎn)品中污染占比最高的菌。 起初，Burkholderia cepacia complex（洋蔥伯克霍爾德復(fù)合體）并未被列入控制菌范圍內(nèi)，它對(duì)藥品的潛在威脅性是在2018年9月底舉行的PDA/FDA會(huì)議中被提出的。目前，在2019年12月1日生效的《美國(guó)藥典》中，已經(jīng)將Burkholderia cepacia complex（洋蔥伯克霍爾德復(fù)合體）納入了控制菌檢查項(xiàng)目。 如何判定是否為“不可接受微生物”？ 我們不能因?yàn)槟承┤顺院ｕr過(guò)敏而禁止所有人食用海鮮，同樣的，不能因?yàn)樗幤分写嬖谖⑸飳?duì)于某些人群有害而禁止所有人使用，因此對(duì)于是否判定為“不可接受微生物”對(duì)于不同的藥品生產(chǎn)廠家可能也需要有更為詳細(xì)的考量因素，例如：藥品的給藥途徑、藥品的特性（是否促進(jìn)微生物生長(zhǎng)或者是否有足夠的抑制微生物生長(zhǎng)能力）、藥品的使用方法、用藥人群（如新生兒、嬰幼兒及體弱者，風(fēng)險(xiǎn)可能不同）、患者使用免疫抑制劑和甾體類(lèi)固醇激素等藥品；存在疾病、傷殘和器官損傷等。 在21 CFR 211.84(d)(6) ，21 CFR 211.113(a)，21 CFR 211.165(b)提供了對(duì)“不可接受生物”的一些指導(dǎo)原則。不過(guò)，這些指導(dǎo)原則并未對(duì)”不可接受微生物“做出定義。監(jiān)管機(jī)構(gòu)也不提供“不可接受微生物“的列表，而是希望生產(chǎn)廠商通過(guò)分析來(lái)決定自己產(chǎn)品里的“不可接受微生物“，并進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制。 在cGMP（動(dòng)態(tài)藥品生產(chǎn)管理規(guī)范）中，對(duì)“不可接受微生物”也沒(méi)有進(jìn)行詳細(xì)的規(guī)定，但是其一般具有以下幾個(gè)屬性： 首先，這個(gè)概念是針對(duì)非無(wú)菌產(chǎn)品的。對(duì)無(wú)菌產(chǎn)品而言，所有的微生物都不可接受； 其次，不可接受微生物是產(chǎn)品特異的?？稍谔囟ǖ漠a(chǎn)品中增殖，對(duì)該藥品的化學(xué)、物理、功能和治療屬性產(chǎn)生不利影響的微生物； 另外，在產(chǎn)品中有足夠的數(shù)量并因具有致病性而在給藥時(shí)可導(dǎo)致患者感染的微生物，也被認(rèn)為是不可接受的。 在《中國(guó)藥典》2015版第四部提到：對(duì)于原料、輔料及某些特定的制劑，根據(jù)輔料及其制劑的特性和用、制劑的生產(chǎn)工藝因素，可能還需檢查其他有潛在危害的微生物，可見(jiàn)藥典中也沒(méi)有詳細(xì)列出哪些是“不可接受微生物”。 以Burkholderia cepacia（洋蔥伯克霍爾德氏菌）為例，該菌是一種嚴(yán)重的機(jī)會(huì)性人類(lèi)病原體，參與囊性纖維化患者的感染，且對(duì)多種抗生素有耐藥性，且在一些消毒劑、防腐劑中也能找到該菌的存在，對(duì)于免疫力較強(qiáng)的健康人可能不致病，但是對(duì)于新生兒、晚期老年和囊性纖維化患者(包括其他患者)尤其危險(xiǎn)，如果藥物是用于這類(lèi)人群則不應(yīng)有Burkholderia cepacia（洋蔥伯克霍爾德氏菌）存在，另外也不應(yīng)存在于用于鼻腔通道或者肺部的藥物中。 那么除了Burkholderia cepacia complex（洋蔥伯克霍爾德復(fù)合體），是否可能存在其他“不可接受微生物”？還有哪些條件致病菌也可以被列為特定類(lèi)型藥品的“不可接受微生物”？ 與其被動(dòng)的等待微生物污染事件爆發(fā)后的總結(jié)歸納，我們更應(yīng)該做的是防范于未然。通過(guò)對(duì)生產(chǎn)環(huán)境和產(chǎn)品進(jìn)行一定水平的微生物監(jiān)測(cè)，結(jié)合臨床等其他信息，盡可能的去識(shí)別和發(fā)現(xiàn)那些可能對(duì)藥品質(zhì)量或者人體健康存在重要影響的微生物，并將它們納入“不可接受微生物”控制列表，從源頭上扼制可能發(fā)生的危害，以避免患者的生命健康受到威脅，也避免對(duì)醫(yī)藥企業(yè)自身造成經(jīng)濟(jì)損失。 “ 長(zhǎng)按二維碼 吧

在上一期，我們回顧FDA藥品召回時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)有不同類(lèi)型的微生物與藥品召回相關(guān)。除了革蘭氏陰性細(xì)菌（如Burkholderia cepacia complex洋蔥伯克霍爾德復(fù)合體）外，真菌污染也是召回的主要原因之一。（傳送門(mén)） 這類(lèi)召回主要與非無(wú)菌藥品相關(guān)，真菌污染可能導(dǎo)致藥品的有效成分失活，藥品保質(zhì)期縮短，也可能威脅患者健康。導(dǎo)致真菌污染的原因主要有生產(chǎn)設(shè)施的設(shè)計(jì)缺陷、生產(chǎn)過(guò)程控制不足或材料缺陷。 接下去要給大家分享的這篇文章所要討論的就是生產(chǎn)設(shè)施設(shè)計(jì)和運(yùn)行問(wèn)題引起的真菌污染。 文章主要內(nèi)容 文中提到，在真菌引起的召回事件中，監(jiān)管機(jī)構(gòu)似乎更關(guān)注藥品潔凈室中的真菌污染問(wèn)題。在GMP檢查、FDA警告信等監(jiān)管機(jī)構(gòu)的調(diào)查報(bào)告中，藥品潔凈室、冷藏室和受控區(qū)域的真菌污染問(wèn)題經(jīng)常被提及。 潔凈室需要特別關(guān)注真菌的原因，主要是它們會(huì)產(chǎn)生孢子，一旦在某個(gè)區(qū)域檢測(cè)到這些孢子，就說(shuō)明真菌孢子已經(jīng)無(wú)處不在了。因?yàn)樗鼈兿鄬?duì)容易傳播，且很難被清除。真菌主要有酵母、絲狀真菌或同時(shí)具有前述兩種狀態(tài)的真菌，如白色念珠菌（被稱(chēng)為雙相真菌）。 文章先回顧了一些召回事件，以便了解污染問(wèn)題的背景，然后聚焦于真菌污染溯源，從真菌的特性、需要被關(guān)注的潛在污染區(qū)域、影響污染引入的可能因素等角度展開(kāi)了一系列的研究，并對(duì)于制藥生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)控中真菌污染呈現(xiàn)上升趨勢(shì)的問(wèn)題，提出了一些糾正措施和預(yù)防措施。 真菌污染引起的藥品召回 在藥品生產(chǎn)環(huán)境中的真菌可能來(lái)源于空氣、水、人員和各種的原料。多年來(lái)，已有許多真菌問(wèn)題在藥品潔凈室、冷藏室和受控區(qū)域被報(bào)道。無(wú)菌藥品和非無(wú)菌藥品均受到了影響。其中，最臭名昭著的無(wú)菌藥品真菌污染案例可能是2012年的新英格蘭合成藥物中心受污染的藥物導(dǎo)致腦膜炎疫情大爆發(fā)。 由于缺乏環(huán)境管控和設(shè)施設(shè)計(jì)，導(dǎo)致了如Exserohilum rostratum（嘴突臍孢） 、Aspergillus fumigatus （煙曲霉）以及潔凈室常見(jiàn)的霉菌Cladosporium （芽枝霉屬）的部分種等真菌的生長(zhǎng)和繁殖。 不過(guò)，主要受影響的還是非無(wú)菌藥品。下面列舉了一些曾被召回產(chǎn)品的類(lèi)型，信息主要來(lái)自FDA的警告信和其他的監(jiān)管發(fā)文。曾被召回的產(chǎn)品類(lèi)型主要包括：Aminocarproic糖漿、硫酸鋇、阿米卡糖漿、Dial brand dialyte concentrate 、電解質(zhì)溶液、干性護(hù)膚霜、酸性洗液、護(hù)膚霜、Preparation H軟膏、Penecare乳液、Aidex 噴霧、藥妝棉片、口服混懸液、VE綿羊油乳液、綿羊油身體乳、氟化鈉漱口水、碳酸氫鹽懸浮液、氨芐西林懸浮液、孕酮霜。 受影響的產(chǎn)品與不同類(lèi)型的真菌有關(guān)。由于生產(chǎn)環(huán)境（地理位置等）和產(chǎn)品成分的差異，可能會(huì)造成某一些真菌菌種的生長(zhǎng)超過(guò)另一些菌種。在一些案例中，產(chǎn)品污染菌與環(huán)境中分離到的真菌有一定的相關(guān)性。 與潔凈室相關(guān)的真菌類(lèi)型 文章作者根據(jù)國(guó)際文獻(xiàn)總結(jié)了藥品潔凈室和藥品中主要的真菌類(lèi)型。雖然存在一定的區(qū)域性差異，但是真菌類(lèi)型仍然存在著普遍的相似性。 這些真菌在外界環(huán)境中普遍存在且通過(guò)氣流擴(kuò)散。 小編：跟我們?cè)?017-2018年年度報(bào)告中的分析到的常見(jiàn)真菌檢出類(lèi)型基本一致（傳送門(mén)） 對(duì)于進(jìn)入制藥環(huán)境的真菌，我們最關(guān)注的就是孢子的產(chǎn)生。真菌孢子是微小的生物顆粒，真菌產(chǎn)生孢子的原因有兩個(gè)：第一個(gè)原因是真菌的繁殖需要，這個(gè)功能與植物的種子類(lèi)似——盡管它們的機(jī)制不同。這些孢子的名稱(chēng)根據(jù)真菌的類(lèi)型和生理狀態(tài)的不同而不同。例如：孢囊孢子、接合孢子、子囊孢子等等。真菌通常根據(jù)其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)分類(lèi)，例如，子囊菌綱（ascomycetes）的特征就是孢子由一個(gè)子囊產(chǎn)生。子囊孢子的子囊是一個(gè)類(lèi)似于“豌豆莢”的結(jié)構(gòu)，它將孢子始終保持在最佳環(huán)境下，直到孢子被釋放出來(lái)（包括酵母菌的孢子）。 真菌產(chǎn)生孢子的第二個(gè)原因是有一些真菌可以產(chǎn)生被稱(chēng)為厚壁孢子的特殊孢子（如念珠菌屬、革耳菌屬和被孢霉目的各個(gè)種）。這些真菌的厚壁休眠孢子主要被用于不利條件下的生存需要。 真菌孢子易擴(kuò)散性 真菌孢子可以是單細(xì)胞的，也可以是多細(xì)胞的，通過(guò)真菌復(fù)雜的生命周期發(fā)展成許多不同的階段。例如，對(duì)于絲狀真菌，其生長(zhǎng)過(guò)程是通過(guò)產(chǎn)生菌絲（管狀分枝），在菌絲的多個(gè)方向上同步展開(kāi)（稱(chēng)為菌絲體）。一些菌絲分支生長(zhǎng)到空氣中，孢子在這些空中分支上形成。 真菌的孢子可以傳播很遠(yuǎn)的距離。重要的是，真菌的孢子不同于細(xì)菌的孢子。細(xì)菌孢子是靜態(tài)的，除非物理遷移；而真菌孢子可以隨著氣流進(jìn)行長(zhǎng)距離傳播，這取決于真菌的類(lèi)型（如孢子大小等）和當(dāng)時(shí)的情況。 這意味著，對(duì)于潔凈室這樣的封閉空間，真菌孢子很容易散布的到處都是。 真菌孢子在潔凈室中生存 潔凈室環(huán)境并不一定能夠?yàn)檎婢咦拥纳婧蛷?fù)蘇提供理想的環(huán)境條件。干燥、結(jié)構(gòu)合理且定期消殺的潔凈室并不適合真菌孢子生存。由于孢子是作為真菌生存機(jī)制的一部分而產(chǎn)生的，如厚壁孢子，這些厚壁孢子能夠更好的適應(yīng)不利的環(huán)境條件（如炎熱和干燥的環(huán)境條件、缺乏營(yíng)養(yǎng)、滲透壓的變化以及不利的pH值和化學(xué)物質(zhì)等）。這種真菌孢子是厚壁、深色、球形、微小的生物顆粒，因此能夠在潔凈室等環(huán)境中生存。 在進(jìn)入潔凈室的所有類(lèi)型的真菌孢子中，當(dāng)條件有利時(shí)，一部分真菌孢子復(fù)蘇或者存活，尤其是在結(jié)構(gòu)不合理或者潮濕的潔凈室中。例如，乙烯基塑料下面存在水，將可能導(dǎo)致真菌的生長(zhǎng)繁殖。 研究表明，真菌在有水的地方可以更好的生長(zhǎng)，存活更長(zhǎng)的時(shí)間（當(dāng)然，沒(méi)有證據(jù)表明真菌能在氣流中生長(zhǎng)，或者可以利用氣流促進(jìn)生長(zhǎng)）。真菌的存在和灰塵也有關(guān)聯(lián)；當(dāng)水和灰塵顆粒存在時(shí)，真菌存活率提高。當(dāng)真菌沉降到表面時(shí)，這些環(huán)境因素加上真菌孢子就成了潔凈室中的一個(gè)特殊問(wèn)題。 真菌孢子是否存活，這將取決于潔凈室的一系列特定條件以及潔凈室所在的地理位置。在生物地理學(xué)模型中，這些受到自然選擇、群落分布、群落遷移和物種形成的影響。另一個(gè)因素是真菌種類(lèi)，影響生存的一般因素有：溫度、水和水活度、有機(jī)物濃度、氫離子濃度、無(wú)機(jī)物濃度、空氣中粒子濃度、氧化還原電位、氣壓、光強(qiáng)度、地理位置和棲息地。 環(huán)境監(jiān)測(cè)要點(diǎn) 評(píng)估藥品潔凈室中的真菌情況的前提是環(huán)境監(jiān)測(cè)程序能夠持續(xù)的檢測(cè)真菌，并且能夠反映所在環(huán)境的典型情況。此外，監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)應(yīng)滿足進(jìn)行趨勢(shì)分析的需求。在檢測(cè)方面，需要考慮培養(yǎng)基（涉及用于采集細(xì)菌和真菌的通用瓊脂平板，或特定的真菌培養(yǎng)基）和培養(yǎng)條件。這些重要的考慮因素應(yīng)在環(huán)境監(jiān)測(cè)計(jì)劃中詳細(xì)說(shuō)明。 進(jìn)一步的考慮是方法的選擇，依靠空氣監(jiān)測(cè)和表面監(jiān)測(cè)的雙重監(jiān)測(cè)方法很重要。大多數(shù)的潔凈室真菌源于氣生菌群，在合適的條件下或可沉降到表面（如重力作用或者氣流沖擊物體）。 此外，真菌也可以通過(guò)物品和人攜帶進(jìn)入潔凈室。有機(jī)物和水可以促進(jìn)真菌的生長(zhǎng)，這對(duì)真菌在表面的復(fù)蘇很重要。盡管沒(méi)有科學(xué)證據(jù)表明真菌能在空氣生長(zhǎng)中，但氣流是傳播孢子的有效媒介，開(kāi)放加工環(huán)節(jié)的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)應(yīng)側(cè)重于對(duì)氣流的監(jiān)測(cè)。 制藥環(huán)境的真菌污染來(lái)源 制藥生產(chǎn)環(huán)境內(nèi)存在著多個(gè)可能導(dǎo)致真菌污染來(lái)源。在某種程度上，這取決于生產(chǎn)操作的類(lèi)型、環(huán)境控制的執(zhí)行情況以及清潔和消毒體系的徹底性。 在潔凈環(huán)境中，真菌的來(lái)源很廣泛，包括門(mén)踢腳板、袋子、培養(yǎng)箱、盒子、記號(hào)筆、干預(yù)設(shè)備、推車(chē)輪、天花板瓷磚、維護(hù)不善的地面等，在某些情況下，還包括高壓清洗設(shè)備。房間氣壓不足、建筑震動(dòng)、設(shè)計(jì)不合理的噴淋和燈光系統(tǒng)也是 潔凈室真菌爆發(fā)的原因。環(huán)境的變化（例如環(huán)境溫度升高），加上被帶進(jìn)潔凈室的物品，也是真菌污染爆發(fā)的可能原因。潮濕或濕潤(rùn)的區(qū)域是另一個(gè)在潔凈環(huán)境中可以促進(jìn)真菌生長(zhǎng)的因素。 由于真菌污染的來(lái)源多種多樣，必須考慮所有可能導(dǎo)致污染的潛在因素，包括設(shè)施設(shè)計(jì)和維護(hù)（與暖通空調(diào)相關(guān)的環(huán)境控制系統(tǒng)），進(jìn)入潔凈室的物品，人員操作規(guī)范和適當(dāng)?shù)目捎糜谇鍧嵑拖镜漠a(chǎn)品。 制藥生產(chǎn)環(huán)境中的潛在真菌污染來(lái)源（魚(yú)骨圖） 對(duì)任何污染事件的評(píng)估都應(yīng)該通過(guò)調(diào)查和根本原因分析來(lái)解決，有不同的技巧可以用于此類(lèi)調(diào)查。為了更好的完成調(diào)查，正確的定義和描述事件或問(wèn)題很重要（問(wèn)“五個(gè)為什么”這個(gè)技巧在這里很有用）。隨后，應(yīng)確定從正常情況到關(guān)注點(diǎn)的時(shí)間線。風(fēng)險(xiǎn)工具如故障模式和影響分析（FEMA）和危害分析與關(guān)鍵點(diǎn)控制（HACCP）等通常是有效的，使用“是/不是”表和矛盾矩陣等方法收集信息并找出疑問(wèn)，這些方法有助于區(qū)分根本原因和影響因素。這些方法是有助于呈現(xiàn)問(wèn)題的預(yù)測(cè)方法。 接下來(lái)要更詳細(xì)的探討一些需要考慮的更常見(jiàn)區(qū)域和需要采取的行動(dòng)。 真菌與建筑環(huán)境的關(guān)系 盡管真菌通常在潔凈室不會(huì)大量存在，但潔凈室的墻壁上可能存在真菌，真菌將會(huì)對(duì)通風(fēng)系統(tǒng)構(gòu)成挑戰(zhàn)，這些區(qū)域的缺陷可能導(dǎo)致真菌進(jìn)入。這一點(diǎn)很重要，因?yàn)樵谌魏谓ㄖ校瑤缀鯖](méi)有發(fā)現(xiàn)天然存在于室內(nèi)的真菌，大多數(shù)在室內(nèi)發(fā)現(xiàn)的真菌都來(lái)自于外部環(huán)境，它們通過(guò)某種機(jī)制被帶入室內(nèi)環(huán)境。因此，當(dāng)外部群落發(fā)生變化時(shí)，室內(nèi)浮游真菌群落也會(huì)發(fā)生變化。 這里有兩種主要類(lèi)型的缺陷：未經(jīng)過(guò)濾的空氣進(jìn)入，比如通過(guò)有故障通風(fēng)系統(tǒng)；隨著水流進(jìn)入，如管道泄漏。氣流和水流都可以在相當(dāng)大的范圍內(nèi)傳播真菌孢子。 在這兩類(lèi)缺陷中，與空氣有關(guān)的糾正措施更容易實(shí)現(xiàn)，前提是執(zhí)行強(qiáng)有力的清潔和消毒措施（使用合適的殺孢子劑）。而漏水可能是由于損壞的設(shè)施結(jié)構(gòu)導(dǎo)致，尤其是密封設(shè)備和乙烯基塑料。這種情況下，清潔和消殺活動(dòng)可能會(huì)加劇真菌孢子的傳播。 此外，如果水在乙烯基塑料下面流動(dòng)，有可能導(dǎo)致真菌孢子的大范圍傳播。在這種情況下，水的持續(xù)存在將導(dǎo)致擴(kuò)散的增加。尤其是水和水汽凝結(jié)可能導(dǎo)致大范圍的枝孢霉屬（Cladosporium）孢子污染。 除了產(chǎn)品污染風(fēng)險(xiǎn)外，大多數(shù)環(huán)境相關(guān)的真菌也會(huì)給操作者帶來(lái)健康風(fēng)險(xiǎn)。例如，真菌毒素、微生物揮發(fā)性有機(jī)物、釋放到室內(nèi)的微粒都有可能成為過(guò)敏原。 生產(chǎn)環(huán)境的現(xiàn)狀 生產(chǎn)環(huán)境的現(xiàn)狀與管道破損情況和企業(yè)通過(guò)有效的清潔和消毒程序應(yīng)對(duì)事故的反應(yīng)能力有關(guān)（因?yàn)閾p壞的表面更難清潔和消毒）。發(fā)生這種情況的可能性取決于對(duì)特定設(shè)施的維護(hù)情況，雖然隨著設(shè)施的老化，良好的維護(hù)變的更加困難（在制藥領(lǐng)域，一般超過(guò)25年的設(shè)施可能被定義為老化）。 此外，與水和溫度一樣，對(duì)真菌的影響因素還包括室內(nèi)的高濕度及有限的通風(fēng)。較高的通風(fēng)率降低了真菌的持留，同時(shí)需要考慮給予建筑組件溫濕性能。 生產(chǎn)設(shè)備的保養(yǎng) 維護(hù)不善的設(shè)備也可能是真菌來(lái)源之一，修復(fù)破損設(shè)備也應(yīng)該成為設(shè)施真菌防御策略的一部分。例如，過(guò)濾器磨損或損壞，可能造成設(shè)施空氣泄漏。 另外一個(gè)關(guān)注點(diǎn)是后續(xù)維護(hù)活動(dòng)，例如打開(kāi)機(jī)器上的面板，設(shè)備的內(nèi)部區(qū)域，特別是那些通常不會(huì)暴露在潔凈室環(huán)境中的區(qū)域，可能是污染源。 生產(chǎn)人員 生產(chǎn)人員通常應(yīng)受過(guò)良好的培訓(xùn)，但可能出現(xiàn)與個(gè)人衛(wèi)生有關(guān)的問(wèn)題（與進(jìn)入設(shè)施有關(guān)，如在第一換衣區(qū)脫掉室外衣服和洗手）。真菌的水平和人體皮膚的固有微生物群落有關(guān)。人員會(huì)通過(guò)帶入土壤引入污染，特別在鞋子上。更換受控的鞋子進(jìn)入潔凈室區(qū)域是一件特別重要的事情（加上穿防潮的潔凈室襪子），同時(shí)穿著合適的潔凈室服裝、手套和口罩。其他人員變量主要與清潔和消毒的有效性有關(guān)，特別是當(dāng)采用臨時(shí)工（合同工）進(jìn)行這類(lèi)活動(dòng)時(shí)。這些人員活動(dòng)行為應(yīng)當(dāng)通過(guò)培訓(xùn)加以規(guī)范。 特定真菌的檢測(cè) 對(duì)真菌的鑒定有時(shí)候可以提供關(guān)于其來(lái)源的線索，源于空氣、建筑環(huán)境和水等。這使得鑒定變得很重要，無(wú)論是通過(guò)視覺(jué)手段鑒定還是通過(guò)微生物鑒定系統(tǒng)。雖然世界上只有一小部分真菌種類(lèi)被描繪出來(lái)，但是通過(guò)鑒定，我們發(fā)現(xiàn)那些可能在潔凈生產(chǎn)環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)的真菌也屬于一個(gè)狹小的類(lèi)群。 鑒定的方法包括對(duì)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行形態(tài)觀察，與手冊(cè)進(jìn)行對(duì)比；表型鑒定系統(tǒng)；基因型方法，如檢測(cè)大核糖體亞基（LSU）的D1/D2區(qū)域或者內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1/ITS2）。 小編：常見(jiàn)潔凈室真菌： 常見(jiàn)環(huán)境真菌——青霉屬和曲霉屬 建筑和潮濕環(huán)境——芽枝霉屬 人源——曲霉屬、青霉屬、Trychophyton（毛癬菌屬） 當(dāng)然，鑒于許多真菌的普遍存在性，這些結(jié)論并不是確鑿無(wú)疑的。對(duì)潔凈室微生物菌群的定期回顧可以為任何分離到的真菌在常規(guī)的環(huán)境微生物菌落中的占比高低提供線索。這類(lèi)回顧對(duì)于消毒劑的效果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也非常重要。 糾正措施 大體上有兩種糾正措施：第一是發(fā)現(xiàn)問(wèn)題的根源并加以糾正；第二是修復(fù)問(wèn)題區(qū)域，包括進(jìn)行維修和運(yùn)行有效的清潔和消毒制度。后者涉及到最佳消毒劑類(lèi)型的選擇-其中一種是殺孢子劑，并已證明其對(duì)清除（設(shè)備/環(huán)境）表面真菌孢子的效果。 在對(duì)問(wèn)題響應(yīng)的方面，一個(gè)常見(jiàn)的問(wèn)題的潮濕區(qū)域或者因漏水而受損的區(qū)域。潔凈室人員應(yīng)迅速對(duì)設(shè)施內(nèi)的漏水情況作出反應(yīng)，盡快修復(fù)或者更換損壞的墻壁和天花板。 真菌孢子對(duì)許多化學(xué)物質(zhì)都有抗性。真菌細(xì)胞可能對(duì)一種或多種常用的殺菌劑具有通透性屏障的固有能力。理論上，真菌孢子比細(xì)菌內(nèi)生孢子更容易殺死，然而實(shí)際上并非總是如此。有些真菌能分泌酶，干擾特定的消毒劑并使其失活。此外，如果一個(gè)區(qū)域有真菌存在，那么真菌孢子通常比細(xì)菌多得多，因而對(duì)清潔和消殺的挑戰(zhàn)更大。為了克服這個(gè)問(wèn)題，必須要進(jìn)行多輪清潔和消毒。 清潔和消毒的關(guān)鍵： a) 使用有效的清潔劑。在有泥土、灰塵、碎片等地方，消毒劑的滲透性較差（比如像潔凈室中石膏面板掉落的情況），在使用消毒劑之前，需要先進(jìn)行有效的清潔。 b) 使用一種以上的消毒劑是明智的。 c) 選用的消毒劑必須具抗一系列真菌的能力。消滅孢子（細(xì)菌和真菌）通常更需要不同的接觸時(shí)間，而不是標(biāo)準(zhǔn)消毒周期。 d) 為了殺死孢子，包括細(xì)菌和真菌，需要使用殺孢子劑。除了殺死孢子外，殺孢子劑還可以殺死所有的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。 e） 消毒劑需要在規(guī)定的接觸時(shí)間內(nèi)，在有效的溫度范圍內(nèi)使用。反復(fù)擦拭，可以提高消毒劑的效果。 合適的消毒劑類(lèi)型包括含氯類(lèi)或者過(guò)氧乙酸類(lèi)，或過(guò)氧化氫，或過(guò)氧乙酸和過(guò)氧化氫的混合物。在消毒劑能夠達(dá)到有機(jī)體并有足夠接觸時(shí)間的情況下，目前沒(méi)有已知的因素表明，潔凈環(huán)境表面的普通真菌能夠抵抗消毒劑。 影響消毒劑對(duì)真菌（以及對(duì)細(xì)菌內(nèi)孢子）的有效性的一些因素有： a) 該藥劑的固有生物殺滅活性； b) 消毒劑的濃度； c) 接觸時(shí)間。接觸時(shí)間可能會(huì)因?yàn)闈崈羰业牟煌兴煌?。一些高氣流的潔凈室的換氣效率比其他潔凈室快，這可能導(dǎo)致殺孢子劑干燥得更快。由于干燥速度更快，可能需要重新涂抹。 d) 待消毒表面的性質(zhì)。在不同的表面，消毒劑效果存在差異。此外，隨著表面老化（形成隆起等），微生物可以黏附的更深，消毒劑可能無(wú)法有效滲透。 e) 表面的清潔度。殺孢子劑在有污垢的地方滲透能力特別差。 f) 應(yīng)用方法。殺孢子劑應(yīng)用于表面的方法需要明確定義。在幾乎所有情況下，噴灑和擦拭比僅僅簡(jiǎn)單的噴灑更有效。 g) 表面的物化性質(zhì)。（可能影響微生物表面粘附） h) 用來(lái)稀釋消毒劑的水的硬度。 i) 微生物種類(lèi)和數(shù)量（微生物越多，種群越難殺死）。 j) 溫度。大多數(shù)殺孢子劑在低溫下效果很差，比如在寒冷的房間里。 k) 穩(wěn)定性。一個(gè)影響因素，關(guān)系到消毒劑被制備好后是否穩(wěn)定。 通過(guò)對(duì)生產(chǎn)環(huán)境的微生物群落的評(píng)估來(lái)進(jìn)行消毒劑效果的評(píng)價(jià)是一個(gè)好方法。 預(yù)防措施 作為糾正措施的延伸，對(duì)真菌污染更進(jìn)一步的預(yù)防措施是對(duì)潔凈室進(jìn)行良好的設(shè)計(jì)。例如，這里的設(shè)備應(yīng)具有足夠的空調(diào)控制系統(tǒng)，例如ISO 14644 9級(jí)（歐盟GMP D級(jí)，實(shí)施中）區(qū)域的換氣率至少是每小時(shí)15次，以及ISO 14644 8級(jí)（歐盟GMP C級(jí)，實(shí)施中）區(qū)域換氣率每小時(shí)20次。同時(shí)，還需要考慮空氣分配，以確保潔凈室的所有區(qū)域都能獲得新鮮和適當(dāng)調(diào)節(jié)的空氣，因?yàn)槭覂?nèi)機(jī)械通風(fēng)對(duì)建筑物內(nèi)的微生物群落有重大影響。 此外，在生產(chǎn)環(huán)境中使用的織物應(yīng)采用不吸水或不促進(jìn)真菌生長(zhǎng)的無(wú)孔材料。為了增加進(jìn)一步的保護(hù)，可以使用一些抗真菌涂料和油漆?？照{(diào)控制系統(tǒng)的另一方面是提供合適的溫度和濕度控制，避免可能促進(jìn)真菌生長(zhǎng)的極端情況。其他設(shè)計(jì)因素包括確保設(shè)計(jì)的表面便于接近，并且表面易于清潔和消毒。 藥品微生物檢測(cè)人員面臨的問(wèn)題 盡管潔凈生產(chǎn)環(huán)境中的真菌存在與藥品召回之間的聯(lián)系是明確的，但是制藥企業(yè)面臨的任務(wù)并不簡(jiǎn)單。這在一定程度上是由于缺乏真菌檢測(cè)和鑒定等方面的經(jīng)驗(yàn)： 據(jù)Cundell稱(chēng)，制藥企業(yè)面臨的共同問(wèn)題包括： 1、在環(huán)境監(jiān)測(cè)過(guò)程中對(duì)真菌的分離和趨勢(shì)的關(guān)注可能不夠； 2、消殺劑有效性驗(yàn)證可能并不能充分說(shuō)明針對(duì)真菌孢子的消殺活性； 3、在產(chǎn)品或環(huán)境監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)的真菌很難被計(jì)數(shù)。許多采集到的真菌是絲狀的，有帶孢子孢子的氣生菌絲。這種生長(zhǎng)方式會(huì)使得以菌落方式評(píng)估真菌水平的適用性受到質(zhì)疑。 4、在滲水可能促進(jìn)真菌在制藥設(shè)施中生長(zhǎng)缺乏足夠的認(rèn)識(shí)； 5、大多數(shù)的藥物微生物實(shí)驗(yàn)室缺乏可靠的，鑒別真菌屬，特別是真菌種的能力。 需要充分注意上面的每一個(gè)問(wèn)題才有助于解決潔凈室中的真菌帶來(lái)的問(wèn)題。 總   結(jié) 對(duì)潔凈室的風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)導(dǎo)致終端產(chǎn)品的污染，這已有案例。 對(duì)于無(wú)菌產(chǎn)品，在終端產(chǎn)品中檢測(cè)到真菌構(gòu)成重大風(fēng)險(xiǎn)，并將觸發(fā)整個(gè)批次召回。對(duì)于非無(wú)菌產(chǎn)品，如果在終產(chǎn)品測(cè)試中檢測(cè)到真菌，則需要評(píng)估該真菌是否是“不可接受”的。根據(jù)Sutton博士（2006）的說(shuō)法，該風(fēng)險(xiǎn)分析至少應(yīng)該包含四個(gè)獨(dú)立的考慮因素。分別是：所見(jiàn)微生物的絕對(duì)數(shù)量，微生物的特性，產(chǎn)品特性和對(duì)患者的潛在影響。 這意味著評(píng)估潔凈室中的真菌群落成為環(huán)境監(jiān)測(cè)計(jì)劃的重要組成部分，通過(guò)空氣采樣和表面采樣。潔凈室真菌起源于室外，真菌物質(zhì)在室外的遷移情況足以解釋所觀察到的室內(nèi)真菌在空氣中的分布。 通過(guò)對(duì)氣流的評(píng)估來(lái)確定真菌污染擴(kuò)散的難易程度是必要的；對(duì)表面的評(píng)估，特別是在有機(jī)材料和水存在的地方，表明真菌存活和生長(zhǎng)的可能性。 因此需要制定監(jiān)測(cè)方法、制備平皿和培養(yǎng)。另一個(gè)問(wèn)題是真菌的溯源、趨勢(shì)分析和鑒定，因?yàn)橹扑幤髽I(yè)的微生物實(shí)驗(yàn)室中往往缺乏有豐富經(jīng)驗(yàn)的真菌專(zhuān)家。這可能導(dǎo)致低估真菌和產(chǎn)品污染事件之間的關(guān)聯(lián)，并影響對(duì)潔凈室和受控環(huán)境的評(píng)估。 一旦真菌被大量發(fā)現(xiàn)，就需要采取措施消滅真菌種群。這通常與消除水源、修復(fù)損壞和有效消毒有關(guān)。這些措施需要迅速采取，以盡量減少真菌繁殖和擴(kuò)散的幾率。還需要改進(jìn)潔凈室的設(shè)計(jì)，以幫助最大限度地減少真菌進(jìn)入潔凈室的可能性，并降低真菌留在受控環(huán)境的可能性。 原文：Investigating and Addressing Fungal Contamination in Pharmaceutical Cleanrooms By Tim Sandle Mar 23, 2018 6:05 am PDT “ 長(zhǎng)按二維碼 吧

前    言 近年來(lái)，越來(lái)越多的法規(guī)、文獻(xiàn)，甚至是FDA的警告信中，都不斷提及在無(wú)菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證、清潔和消毒劑效能驗(yàn)證、無(wú)菌工藝驗(yàn)證等各種微生物相關(guān)的驗(yàn)證中，除了使用標(biāo)準(zhǔn)菌株以外，也應(yīng)當(dāng)使用企業(yè)自身環(huán)境中分離到的具有代表性的微生物進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。 那么，哪些菌才具有代表性呢？ 這就需要企業(yè)對(duì)環(huán)境監(jiān)測(cè)中分離到的微生物進(jìn)行屬和種水平的鑒定（在超限時(shí)對(duì)采集到的微生物進(jìn)行鑒定，以及在未超限時(shí)進(jìn)行周期性的環(huán)境微生物鑒定），并且對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，以確定常見(jiàn)的微生物類(lèi)型，然后根據(jù)微生物的種類(lèi)特征和數(shù)量從中篩選，進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。 當(dāng)然，環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫(kù)建立的意義不止于此，數(shù)據(jù)庫(kù)的建立有助于企業(yè)了解藥品生產(chǎn)過(guò)程中微生物的負(fù)載情況，對(duì)于建立有效的生產(chǎn)過(guò)程微生物污染溯源分析體系具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。 環(huán)境菌庫(kù)的應(yīng)用 我們（浙江省微生物研究所）對(duì)2017-2018年積累的環(huán)境微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)和分析，樣本采樣點(diǎn)絕大部分為相關(guān)企業(yè)潔凈區(qū)或其他受控環(huán)境，涵蓋制藥、食品、化妝品等行業(yè)，其中以制藥企業(yè)為主?；诒Ｃ茉?，我們并不要求企業(yè)提供詳細(xì)采樣地點(diǎn)，但通過(guò)對(duì)歷史數(shù)據(jù)的分析，我們?nèi)匀话l(fā)現(xiàn)了一些有意思的東西，與大家分享。 細(xì)菌真菌檢測(cè)比例變化趨勢(shì) 2018年全年真菌月度平均檢出率為11.4%，這一數(shù)值高于隨機(jī)抽取的10家環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)情況較好的制藥企業(yè)的真菌檢出率（3%-6%）。對(duì)此，我們并不意外，相比于細(xì)菌多種多樣的鑒定手段，真菌的鑒定手段就顯得匱乏一些。因此，企業(yè)在分離到真菌時(shí)，更傾向于委托給我們鑒定。 菌群相關(guān)性分析 我們對(duì)兩年來(lái)鑒定到種或?qū)偎降木N（細(xì)菌鑒定率為98.88%，真菌鑒定率為96.89%）進(jìn)行了聚類(lèi)分析。眾所周知，環(huán)境中的微生物并非獨(dú)立存在，各個(gè)微生物種屬直接存在著復(fù)雜的互作關(guān)系。 企業(yè)在環(huán)境監(jiān)測(cè)中采集到的微生物主要體現(xiàn)為兩類(lèi)關(guān)系：一類(lèi)是Win-Win的互惠關(guān)系，一類(lèi)是Win-lose的抑制關(guān)系；具有互惠關(guān)系的微生物傾向于共同被檢出，而相互抑制的微生物則可能呈現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)。 潔凈環(huán)境中檢出的微生物大致可以分為3類(lèi)： ①與人員攜帶相關(guān)：如葡萄球菌屬（Staphylococcus）、 微球菌屬（Micrococcus）、 短桿菌屬（Brevibacterium）、 莫拉氏菌屬（Moraxella）、 考克氏菌屬（Kocuria）、 皮膚球菌屬（Kytococcus）等，生境主要與人體相關(guān)，在這些菌屬的檢出率上也反映出了一定的正相關(guān)性； ②與水系統(tǒng)相關(guān)：如羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）、 鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、 甲基桿菌屬（Methylobacterium）、 微桿菌屬（Microbacterium）、 污泥單胞菌屬（Pelomonas）等生境主要為水體，常可在水系統(tǒng)中以形成生物膜的積聚，到一定規(guī)模時(shí)可能造成管道堵塞。 ③與土壤相關(guān)：如芽孢桿菌屬（Bacillus）、 類(lèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、 賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus），這些菌屬都具有較強(qiáng)的抗消殺能力，可能為該潔凈室的土著菌屬，也可能由物料、設(shè)備包裝等因素?cái)y帶進(jìn)入潔凈環(huán)境。 從上圖，我們不難看出，不同種屬的微生物之間，以某種方式聯(lián)系在一起。例如，可能為同一來(lái)源的微生物具有共同檢出的傾向。而定殖菌之間可能存在互惠互利的現(xiàn)象，從而實(shí)現(xiàn)在潔凈室環(huán)境的持留。 優(yōu)勢(shì)菌種對(duì)比 我們對(duì)比了2017-2018年檢出率超過(guò)1%的菌種，發(fā)現(xiàn)兩年優(yōu)勢(shì)菌屬和菌種均十分相似。這表明盡管地域、氣候等因素對(duì)菌群結(jié)構(gòu)存在一定的影響，但遵循GMP體系的受控生產(chǎn)環(huán)境總體是具有較高的相似性，因此環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌構(gòu)成也存在著一定的相似性。 這也表明，在持續(xù)受控的環(huán)境中，菌群結(jié)構(gòu)應(yīng)當(dāng)是具有穩(wěn)定性的。研究各個(gè)企業(yè)、各個(gè)時(shí)間這種穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的變化可能有助于我們對(duì)環(huán)境微生物管控水平進(jìn)行更精確，更數(shù)據(jù)化的評(píng)估。 未知菌屬的分類(lèi)和溯源 無(wú)論采用何種的鑒定方法，能否鑒定到種或?qū)?，其?shí)都取決于該方法所依托的背景數(shù)據(jù)庫(kù)的大小。然而無(wú)論多大的數(shù)據(jù)庫(kù)均有其局限性，一旦分離到的菌未被背景數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，我們就無(wú)法獲得其種屬信息。但是，采用基因序列方法進(jìn)行微生物鑒定的優(yōu)勢(shì)在于，即使我們無(wú)法獲得種屬信息，我們依然可以依據(jù)其基因序列的相似性進(jìn)行物種的劃分。因此，我們對(duì)未鑒定到種屬的細(xì)菌（1.12%）和真菌（3.11%）也從序列水平進(jìn)行了分類(lèi)。 未知細(xì)菌97%序列相似度聚類(lèi)  未知真菌97%序列相似度聚類(lèi)  從兩年的數(shù)據(jù)中，我們根據(jù)基因序列的相似度，一共得到了細(xì)菌97%相似度水平集合113個(gè)，99%相似度水平集合218個(gè)，真菌97%相似度水平集合45個(gè)，99%相似度水平集合50個(gè)。 這個(gè)數(shù)量顯然是小于我們實(shí)際的未知菌檢出數(shù)量的，這意味著，有一些未知菌是多次被檢出的（上圖中色塊大小代表97%相似度水平集合的檢出頻次）。這意味著，即便污染菌的鑒定結(jié)果是未知菌屬，我們也可以通過(guò)序列相似度的比較，進(jìn)行基因水平的溯源分析。 同時(shí)，如果對(duì)一些常見(jiàn)未知菌的特性進(jìn)行進(jìn)一步研究，可能有助于我們更好的管控生產(chǎn)環(huán)境的微生物風(fēng)險(xiǎn)。 特定菌屬的回顧分析 除了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)以外，我們也可以利用歷史數(shù)據(jù)運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)手段進(jìn)行一些菌群動(dòng)態(tài)趨勢(shì)的預(yù)測(cè)。如下圖 2017-2018年芽孢桿菌屬（Bacillus）的總體平均檢出率在13.8%左右，總體月度波動(dòng)較小。對(duì)比單個(gè)企業(yè)的抽樣數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)無(wú)菌藥品生產(chǎn)企業(yè)的芽孢檢出率普遍低于10%，一般在6%~8%之間，非無(wú)菌制劑和中藥企業(yè)的檢出率則根據(jù)管控情況不同存在較大波動(dòng)，一般在15%~30%之間，不排除芽孢桿菌檢出率較高的企業(yè)存在選擇性送樣的情況。 另外，我們可以依據(jù)趨勢(shì)推測(cè)，在未來(lái)1-2個(gè)月的芽孢桿菌總體檢出情況應(yīng)當(dāng)會(huì)保持在13-14%%左右，若實(shí)際數(shù)據(jù)與此出現(xiàn)較大偏離時(shí)，可能意味著有不受控情況出現(xiàn)。 后  記 制藥生產(chǎn)環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)微生物是人源的革蘭氏陽(yáng)性桿菌和革蘭氏陽(yáng)性球菌，真菌則是酵母和絲狀真菌，我們的數(shù)據(jù)也體現(xiàn)了這一點(diǎn)。 同時(shí)，我們也在來(lái)源于水環(huán)境的菌中，發(fā)現(xiàn)了一些革蘭氏陰性桿菌，它們通常具有條件致病性，如粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens，又稱(chēng)褪色沙雷氏菌）。 如果企業(yè)的水系統(tǒng)中有這些菌的存在，會(huì)帶來(lái)極高的終產(chǎn)品污染風(fēng)險(xiǎn)。 我們通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)取了2017-2018年腸桿菌屬、粘質(zhì)沙雷菌的檢出數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)月平均檢出率分別為0.6%、0.1%，這個(gè)表明目前國(guó)內(nèi)企業(yè)，對(duì)這些菌的管控非常到位。 產(chǎn)品中污染的微生物來(lái)自于原料，環(huán)境和人員的相互作用。因此，從原材料、環(huán)境、人員和產(chǎn)品中分離檢測(cè)并準(zhǔn)確鑒定其中的微生物，分析微生物的特性，和變化趨勢(shì)，是實(shí)現(xiàn)微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和管控的基礎(chǔ)。通過(guò)建立環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫(kù)，確定對(duì)應(yīng)企業(yè)自身產(chǎn)品的“不可接受微生物”列表，才能更有效地驗(yàn)證生產(chǎn)工藝或者消殺是否能夠有效控制原料或者環(huán)境來(lái)源的“不可接受微生物”，避免其最終污染產(chǎn)品。 后 記 DE 后記 經(jīng)過(guò)連續(xù)幾年的制藥環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)實(shí)踐，我們發(fā)現(xiàn)雖然相比于自然環(huán)境，潔凈環(huán)境的微生物種類(lèi)更少，優(yōu)勢(shì)菌群占比更高，菌群面臨的生存脅迫更大，但潔凈環(huán)境的微生態(tài)仍具有其獨(dú)特的多樣性和穩(wěn)定性。 雖然存在地域差異、產(chǎn)品差異等因素，但各企業(yè)潔凈環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌群仍具有一定的相似性，且在一定程度上遵循“二八原則”，既20%的優(yōu)勢(shì)菌屬占總檢出率的80%。 這使得我們利用已知環(huán)境微生物數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)價(jià)環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)情況，通過(guò)優(yōu)勢(shì)菌群的變化來(lái)指導(dǎo)微生物管控計(jì)劃，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)比較不同企業(yè)間的微生物管控水平成為可能。 推薦閱讀： 【年度報(bào)告】2017年度菌種鑒定分析報(bào)告 【佛系驗(yàn)證】數(shù)據(jù)說(shuō)話，工作菌株為什么只要求5代內(nèi) 【正經(jīng)研究】中藥飲片微生物快速檢測(cè)技術(shù)研究及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法初探 【正經(jīng)研究】超純水系統(tǒng)的微生物威脅 【深度文章】沙門(mén)氏菌選擇性培養(yǎng)基中疑似菌落探討

引言 微生物鑒定通常應(yīng)用于篩查產(chǎn)品中的有害生物、分析環(huán)境微生物菌群以及超限事件的溯源分析，是微生物學(xué)職能的重要組成部分。每個(gè)微生物實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)該開(kāi)發(fā)特定的鑒定策略，包括鑒定對(duì)象、鑒定時(shí)間、鑒定水平以及鑒定方法。 制藥微生物學(xué)的很多內(nèi)容均被列在監(jiān)管機(jī)構(gòu)發(fā)布的指導(dǎo)文件或者綱要中，包括對(duì)中間產(chǎn)品和成品的生物負(fù)載評(píng)估的重要性，以及使用規(guī)范方法監(jiān)測(cè)環(huán)境的必要性，但是有關(guān)微生物的鑒定尚未明確?；谖⑸锉硇突蚧蛐偷蔫b定方法已經(jīng)建立，方法的選擇取決于鑒定的內(nèi)容，需要仔細(xì)分析以確定鑒定什么類(lèi)型的樣品，哪種鑒定水平是合適的（形態(tài)學(xué)、屬或種），以及如何利用已收集的信息。另一個(gè)決策點(diǎn)在于鑒定是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部進(jìn)行，還是外包出去。本文對(duì)以上這些要點(diǎn)進(jìn)行了闡述，并為每個(gè)制藥或醫(yī)療組織的微生物學(xué)家提供了開(kāi)發(fā)微生物鑒定策略的基礎(chǔ)。 微生物鑒定 微生物鑒定可以被定義為“通過(guò)預(yù)先選擇并適合于所研究問(wèn)題的有限范圍的測(cè)試進(jìn)行微生物表征”。有一系列的技術(shù)可以用于微生物鑒定，可追溯到Christian Gram的開(kāi)創(chuàng)性差異細(xì)胞壁染色，并擴(kuò)展到最近的分子生物學(xué)技術(shù)。 微生物鑒定的目的是將一種微生物分離株與另外一種分離株區(qū)分開(kāi)來(lái)，并將該分離株歸類(lèi)于科（屬）和種（這是在表型鑒定可以達(dá)到的最佳水平），甚至是特定的菌株（通過(guò)基因型鑒定；菌株是微生物的遺傳變異體或亞型）。 微生物學(xué)的主要分類(lèi)學(xué)術(shù)語(yǔ)是： Family（科）：一組相關(guān)的菌屬 Genus（屬）：一組相關(guān)的菌種 Species（種）：一組相關(guān)的菌株 Type：種內(nèi)的一組菌株（例如生物型，血清型）； Strain：特定種中的一個(gè)品系或分離株 鑒定可以被認(rèn)為是推定的（給出可能的屬的指示）或確認(rèn)的（指定到種水平的情況下）。確認(rèn)的鑒定結(jié)果最常用種名稱(chēng)表示（例如，Pseudomonas aeruginosa銅綠假單胞桿菌）。種名通常包括兩部分——屬名（Pseudomonas）和種名（aeruginosa）。同樣以假單胞菌為例，有時(shí)候種無(wú)法確定，鑒定結(jié)果為"Pseudomonas species"，縮寫(xiě)為“Pseudomonas sp.”。（通常情況下，"sp."用于單數(shù)，"spp."用于復(fù)數(shù)。） 商業(yè)化的微生物鑒定系統(tǒng)可以分為表型和基因型兩大類(lèi)，此外，蛋白質(zhì)組學(xué)有時(shí)也會(huì)單獨(dú)劃分為一類(lèi)，但是也有些文章認(rèn)為蛋白質(zhì)會(huì)受外界環(huán)境的影響，會(huì)把其歸為表型一類(lèi)?；蛐秃捅硇偷膮^(qū)別在于遺傳上（遺傳信息）?！盎蛐汀笔侵干锏娜窟z傳物質(zhì)（基因）組成，不論表達(dá)與否；“表型”是指生物體個(gè)別或少數(shù)性狀以至全部性狀的表現(xiàn)，例如形態(tài)、發(fā)育或者行為。在不同的環(huán)境下，表型會(huì)隨著環(huán)境條件發(fā)生改變。例如，微生物菌落在兩種培養(yǎng)基上會(huì)呈現(xiàn)不同的顏色，具體的表型變化如表1： 表1. 用于微生物鑒定的表型特征 表型方法 對(duì)于許多實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，表型方法的成本相對(duì)較低，應(yīng)用最為普遍。微生物的表型包括細(xì)胞的大小和形狀、細(xì)胞組成、抗原性、生化活動(dòng)以及對(duì)抗菌劑等的敏感性，通常取決于所使用的培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件。此外，表型反應(yīng)通常包括對(duì)不同化學(xué)物質(zhì)或不同生化標(biāo)志物的反應(yīng)。表型方法基于相對(duì)較少的觀察和測(cè)試能夠鑒定到屬或種水平，這些方法主要依賴于微生物的培養(yǎng)并且要從單菌落的純培養(yǎng)物開(kāi)始。傳統(tǒng)的生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，往往還會(huì)出現(xiàn)人為誤差，影響鑒定結(jié)果的重復(fù)性和再現(xiàn)性，自動(dòng)化設(shè)備的出現(xiàn)改善了這一狀況。 表型鑒定方法一般從染色開(kāi)始，如革蘭氏染色、真菌或細(xì)菌內(nèi)生孢子的特定染色。在比較鑒定和差異的最終結(jié)果時(shí)，革蘭氏染色的結(jié)果可以幫助研究者進(jìn)行有效地錯(cuò)誤排查。此外，其他有用的信息源自肉眼可見(jiàn)的菌落形態(tài)，例如菌落形成和色素沉著。標(biāo)準(zhǔn)菌落外觀的描述可以作為鑒定的有效補(bǔ)充，例如菌落輪廓、表面外觀、氣味、菌落高度、半透明度和顏色。 補(bǔ)充測(cè)試同樣可以輔助鑒定，其可用于代替或支持自動(dòng)化方法（有些是自動(dòng)鑒定測(cè)試系統(tǒng)的組成部分），補(bǔ)充測(cè)試的結(jié)果可以幫助評(píng)估鑒定是否有效。表型方法主要的補(bǔ)充測(cè)試列舉如下：  過(guò)氧化氫酶 該試驗(yàn)用于鑒定具有過(guò)氧化氫酶的細(xì)菌，此類(lèi)細(xì)菌能催化過(guò)氧化氫的分解并伴隨著氧氣的釋放，繼而出現(xiàn)氣泡。過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)通常用于區(qū)別葡萄球菌（Staphylococci）, 微球菌（Micrococci）和 鏈球菌（Streptococci）。它還可以用作補(bǔ)充測(cè)試，以區(qū)分不能合成過(guò)氧化氫酶的嚴(yán)格厭氧細(xì)菌。 氧化酶 該試驗(yàn)旨在檢測(cè)是否存在細(xì)胞色素電子傳遞系統(tǒng)相關(guān)的氧化酶。具有氧化酶的細(xì)菌，首先氧化細(xì)胞色素C，再由氧化型細(xì)胞色素C氧化對(duì)苯二胺，生成有色的醌類(lèi)化合物。 凝固酶 該試驗(yàn)用于從葡萄球菌屬中區(qū)分金黃色葡萄球菌和其他菌種，例如中間葡萄球菌（Staphylococcus intermedius）。診斷試劑盒通過(guò)測(cè)試不同微生物凝集特殊涂層乳膠顆粒的能力，判斷待測(cè)菌種是否具有凝固酶/A蛋白（一種熱穩(wěn)定腸毒素）以達(dá)到區(qū)分的目的。 溶葡球菌酶 溶葡萄球菌素是一種通過(guò)細(xì)胞裂解可以區(qū)分葡萄球菌和微球菌的酶，與未被裂解的微球菌相比，葡萄球菌屬細(xì)胞壁被裂解，細(xì)菌懸液濁度下降或變清。 運(yùn)動(dòng)性（motility） 一些桿狀細(xì)菌可以通過(guò)鞭毛進(jìn)行運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)性測(cè)試可以利用顯微鏡或者宏觀方法（借助特殊的培養(yǎng)基）來(lái)觀察不同微生物的形態(tài)，以確定它們是否運(yùn)動(dòng)。微觀方法還可以區(qū)分真正運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌和布朗運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌。 氧化-發(fā)酵（Oxidative-Fermentative） 該試驗(yàn)使用以葡萄糖為碳源并含有pH指示劑的專(zhuān)門(mén)培養(yǎng)基，隨著葡萄糖發(fā)酵，pH降低并且發(fā)生顏色變化，能夠?qū)⒓?xì)菌分為有氧（氧化）代謝、無(wú)氧（發(fā)酵）葡萄糖或兩種代謝方式都具備的細(xì)菌。該測(cè)試主要用于鑒定革蘭氏陰性細(xì)菌。 選擇性瓊脂上的生長(zhǎng) 特殊培養(yǎng)基用來(lái)培養(yǎng)和區(qū)分不同的微生物群。有許多類(lèi)型的選擇性培養(yǎng)基可用，例如MacConkey瓊脂培養(yǎng)基，它含有膽汁鹽和乳糖，促進(jìn)腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)，抑制非腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)。 選擇性生長(zhǎng)要求 厭氧 a）嚴(yán)格好氧菌-在有氧條件下生長(zhǎng) b）嚴(yán)格厭氧菌-在無(wú)氧和其他氣體存在的條件下生長(zhǎng) c）兼性厭氧菌或好氧菌-在有氧或無(wú)氧環(huán)境下均能生長(zhǎng)，在一種狀態(tài)下生長(zhǎng)狀況良好，另外一種狀態(tài)下也可以維持生存 必要時(shí)，可以作為鑒定或培養(yǎng)過(guò)程的一部分，使用專(zhuān)門(mén)的氣罐進(jìn)行評(píng)估。 溫度 各類(lèi)細(xì)菌對(duì)溫度的要求不同，在制藥環(huán)境中分離的許多微生物是嗜溫的（生長(zhǎng)范圍在20-40°C）。其他的微生物具有特殊的溫度要求，例如嗜熱菌、嗜冷菌等。 溶血 溶血是指由某些細(xì)菌毒素裂解紅細(xì)胞，血紅蛋白逸出，其主要有兩種：一種傳代培養(yǎng)在血瓊脂上時(shí)在菌落周?chē)a(chǎn)生大而清晰的光暈，這是由稱(chēng)為溶血素的細(xì)菌毒素引起的（β-溶血）；另外一種產(chǎn)生瓊脂的綠化或褐變，是由鎂離子的缺失和瓊脂的變色引起的（α-溶血）。該試驗(yàn)主要用來(lái)區(qū)分葡萄球菌屬（Staphylococci）和鏈球菌屬（Streptococci）。 生化測(cè)試系統(tǒng) 生化檢測(cè)方法成本低，是最為常見(jiàn)也是最經(jīng)典的檢測(cè)系統(tǒng)，其中研究細(xì)胞的酶活性是鑒定細(xì)菌的強(qiáng)有力試驗(yàn)。許多生化測(cè)試的基礎(chǔ)是細(xì)菌能夠使用不同的碳源來(lái)獲得維持生命所需的能量，例如，BBL-Crystal system自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)或API鑒定系統(tǒng)。 很多實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在采用半自動(dòng)化表型鑒定系統(tǒng)，例如VITEK（含有多種生化反應(yīng)孔的檢測(cè)卡）或者OmniLog（利用微孔鑒定板的小型化系統(tǒng)）。這種表型方法是通過(guò)排除法工作的，如果測(cè)試中A是陽(yáng)性而B(niǎo) 為陰性，則選擇一組可能的微生物，而排除另外一組，隨后測(cè)試C和D，以此類(lèi)推。該測(cè)試結(jié)果將會(huì)與基于二叉式檢索表的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。另一種方法是使用氣相色譜分析細(xì)胞脂肪酸，其中脂肪酸酯的模式通過(guò)氣相色譜法測(cè)定。通過(guò)氣相色譜（GC-FAME）進(jìn)行的脂肪酸甲酯分析在環(huán)境和臨床微生物的鑒定中已經(jīng)應(yīng)用多年，但是在制藥環(huán)境微生物領(lǐng)域應(yīng)用并不常見(jiàn)。 另外，近年來(lái)，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)和基于蛋白質(zhì)圖譜的MALDI-TOF技術(shù)也被應(yīng)用微生物的鑒定。 基因型方法 基因型方法具有不同類(lèi)型微生物的數(shù)據(jù)庫(kù)，其不依賴于微生物的分離培養(yǎng)基或生長(zhǎng)特征。基因型方法開(kāi)辟了一整套新的種和亞種，并對(duì)親緣關(guān)系相近的種進(jìn)行再分類(lèi)，通過(guò)表型相似性聚集在一起的分類(lèi)單元很可能是多系群（polyphyletic groups）?；蛐头椒òs交和測(cè)序（最常見(jiàn)的是16S rRNA）。通過(guò)分析DNA-DNA同源性或來(lái)自不同細(xì)菌的兩條DNA結(jié)合（雜交）的程度如何，以確定兩種微生物的親緣關(guān)系。 選擇測(cè)序檢測(cè)基因組中16S rRNA區(qū)域的方法的原因是： 1）它具有普遍性，存在于幾乎所有原核生物中； 2）它高度保守，隨著時(shí)間的推移，16S rRNA基因的功能沒(méi)有改變，表明隨機(jī)序列的變化是對(duì)進(jìn)化時(shí)間更準(zhǔn)確的衡量標(biāo)準(zhǔn)； 3）16S rRNA基因足夠大，可用于信息學(xué)分析。 對(duì)于絲狀真菌的鑒定，可能需要更昂貴的方法，例如，基于PCR的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的測(cè)序。一些更新的技術(shù)也取得了進(jìn)展，例如用于真菌感染檢測(cè)的β-D-葡聚糖檢測(cè)，（1-3）-β-D-葡聚糖占真菌細(xì)胞壁成分的50%以上，是真菌細(xì)胞壁的特有成分，其可特異性激活鱟變形細(xì)胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固；Riobprinter是一種全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)，以微生物獨(dú)特的基因組為基礎(chǔ)，可自動(dòng)化同步完成菌株水平的鑒定和分子分型 。 另外一種快速方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）系統(tǒng)，PCR技術(shù)使用DNA聚合酶擴(kuò)增特定的DNA片段，通過(guò)擴(kuò)增“細(xì)菌條形碼”形式的基因序列，利用凝膠電泳分離并可視化以產(chǎn)生對(duì)該菌株特異的“條形碼”。通過(guò)比較測(cè)試，可以定量地檢測(cè)不同生物之間DNA序列的差異，從而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以說(shuō)明生物之間可能的進(jìn)化相關(guān)性。 鑒定方法選擇 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室需要決定是否進(jìn)行基本檢測(cè)（如差異染色）、表型檢測(cè)或基因型檢測(cè)，這通常取決于： a)鑒定量 b)鑒定水平 c)鑒定成本 藥品生產(chǎn)者需要綜合考慮以上因素并決定鑒定在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部進(jìn)行或者外包給其他實(shí)驗(yàn)室。對(duì)于內(nèi)部鑒定，如果每個(gè)月有20-30個(gè)鑒定，出于成本效益的考慮，通常會(huì)選擇半自動(dòng)化方法。由于成本和復(fù)雜性，很少有實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)部進(jìn)行基因型檢測(cè)，但是當(dāng)需要這種鑒定時(shí)（例如，調(diào)查無(wú)菌試驗(yàn)失?。蛐蜋z測(cè)可以考慮選擇合適的供應(yīng)商。 鑒定方法驗(yàn)證 微生物鑒定方法在引入實(shí)驗(yàn)室之前的驗(yàn)證是非常有必要的。例如通常要包括代表性的參考微生物進(jìn)行驗(yàn)證，人員的重復(fù)性以及不同實(shí)驗(yàn)室之間的比較。 鑒定方法審查 使用自動(dòng)化系統(tǒng)降低了進(jìn)行微生物鑒定所需的技能水平，但是有經(jīng)驗(yàn)的微生物學(xué)家對(duì)結(jié)果的解釋仍然很重要。一個(gè)常見(jiàn)的監(jiān)管問(wèn)題是數(shù)據(jù)審查不夠充分，未能對(duì)非典型的鑒定結(jié)果提出質(zhì)疑。環(huán)境里回復(fù)到炭疽芽孢桿菌時(shí)（與蠟樣芽孢桿菌非常接近），制藥微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該對(duì)這一結(jié)果提出質(zhì)疑。分離到無(wú)害的生物也是如此：如果復(fù)原的生物體通常與熱帶昆蟲(chóng)有關(guān)，那么需要考慮實(shí)驗(yàn)室是否真的有可能回復(fù)到它？這種情況下應(yīng)該啟動(dòng)重新鑒定。如果初始篩選操作不正確，例如革蘭氏染色、鑒定試劑盒或者卡片的錯(cuò)誤使用、過(guò)度依賴于一個(gè)單一的鑒定系統(tǒng)，都有可能會(huì)發(fā)生這樣的問(wèn)題。 微生物鑒定策略 建立適當(dāng)?shù)膮^(qū)分水平是鑒定策略的重要考慮因素，這有助于微生物工作人員決定該鑒定哪些樣品以及可以如何使用數(shù)據(jù)。審查結(jié)果應(yīng)采取議定程序的形式，以便在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立一致的程序。如果在GMP檢查期間提出問(wèn)題，書(shū)面的議定程序提供了與監(jiān)管機(jī)構(gòu)討論的途徑。 鑒定水平 鑒定方法的選取基于微生物學(xué)家的需求。在某些情況下，知道微生物是革蘭氏陽(yáng)性菌就足夠了。在其他情況下，微生物學(xué)家可以通過(guò)表型鑒定來(lái)了解微生物的一般情況，評(píng)估生物是否有害（不可接受）或者表示失控。在特定的情況下，例如無(wú)菌試驗(yàn)失敗或者在無(wú)菌灌裝實(shí)驗(yàn)和操作者之間獲得明確聯(lián)系的情況下，可能需要通過(guò)分子手段找到無(wú)菌試驗(yàn)污染物和潔凈室生物之間的聯(lián)系。 在對(duì)微生物偏離的研究中，了解微生物的類(lèi)型可以提供關(guān)于其來(lái)源的寶貴信息。例如，許多革蘭氏陽(yáng)性球菌是人體皮膚菌群的一部分。革蘭氏陽(yáng)性桿菌可以通過(guò)設(shè)備和鞋類(lèi)轉(zhuǎn)移到潔凈區(qū)域，革蘭氏陰性桿菌通常與水源相關(guān)。收集這些數(shù)據(jù)可以提供以下幫助： a)確定從產(chǎn)品或制造環(huán)境中分離出的微生物的來(lái)源； b)幫助進(jìn)行產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，例如非無(wú)菌產(chǎn)品的潛在污染，與無(wú)菌加工區(qū)內(nèi)的侵入有關(guān)的污染； c)確定“典型”微生物概況的任何變化。 然而，需要鑒定的水平（例如鏡檢、屬或種）將根據(jù)所測(cè)位置或產(chǎn)品的關(guān)鍵程度而變化。此時(shí)，不一定都需要鑒定到種水平。例如，對(duì)于從低風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域（例如未分類(lèi)的房間和飲用水）采集的樣本，可以采用簡(jiǎn)單的形態(tài)描述和革蘭氏染色。以下情況需要到屬或種水平的更詳細(xì)的鑒定：較高風(fēng)險(xiǎn)的分離株（例如來(lái)自于原料或成品的分離株）；超過(guò)行動(dòng)限（定義為可能造成危害的閾值）；來(lái)自于高等級(jí)潔凈室的分離株（例如所有無(wú)菌灌裝分離株）。 通過(guò)對(duì)生物體進(jìn)行簡(jiǎn)單分組，可以獲得非常寶貴的信息，如下表2： 表2. 可以從微生物形態(tài)學(xué)中收集到的信息 對(duì)于非無(wú)菌藥物，在審查環(huán)境監(jiān)測(cè)時(shí)，通常不需要基于代謝反應(yīng)的表型鑒定之外的鑒定水平。然而，無(wú)菌產(chǎn)品制造商的高等級(jí)潔凈室則需要更高的鑒定水平，可以對(duì)關(guān)鍵樣品進(jìn)行基因型鑒定，例如無(wú)菌測(cè)試失敗或來(lái)自過(guò)程模擬試驗(yàn)的陽(yáng)性容器。此外，在進(jìn)行無(wú)菌灌裝的限度調(diào)查時(shí)，可以通過(guò)對(duì)不同分離株進(jìn)行表征以確定它們是否相關(guān)。 因此，鑒定水平依賴于區(qū)域（無(wú)菌或者非無(wú)菌生產(chǎn)）和樣本類(lèi)型。盡管沒(méi)有“通用方法”，但是一些重要的場(chǎng)景下可能需要著重考慮： 制藥用水系統(tǒng)：低于警戒線時(shí)可以定期進(jìn)行微生物鑒定以建立典型的污染特征。超過(guò)警戒線時(shí)候尤其要注意，如果是革蘭氏陰性，表示存在與水有關(guān)的污染，當(dāng)相關(guān)計(jì)數(shù)構(gòu)成上升趨勢(shì)的一部分時(shí)，進(jìn)行物種鑒定。達(dá)到或者超過(guò)行動(dòng)限時(shí)，由于生物可能是通過(guò)外部環(huán)境污染而產(chǎn)生的，例如由于管理不善導(dǎo)致的出口管道的污染；或者是由如取樣和試驗(yàn)過(guò)程中無(wú)菌技術(shù)操作不當(dāng)引起。革蘭氏陽(yáng)性菌的鑒定結(jié)果提供的信息有限。應(yīng)對(duì)所有革蘭氏陰性菌進(jìn)行種水平鑒定，判斷其是否為有害生物，這些信息對(duì)于用于配制非無(wú)菌產(chǎn)品的水尤為重要。 無(wú)菌生產(chǎn)：鑒于大多數(shù)設(shè)施采用1 CFU作為行動(dòng)級(jí)別，“低于警告和行動(dòng)級(jí)別”不適用于A級(jí)區(qū)域。B級(jí)區(qū)“低于警告和行動(dòng)級(jí)別”，但是A級(jí)區(qū)檢測(cè)到污染并且需要進(jìn)行比較，B級(jí)區(qū)分離到的樣品進(jìn)行鑒定是十分必要的。A級(jí)區(qū)域超過(guò)行動(dòng)限時(shí)，必須進(jìn)行微生物鑒定，分子手段是首選，并需要對(duì)關(guān)聯(lián)環(huán)境分離到的微生生物樣本進(jìn)行充分鑒定和比較，分析污染的關(guān)聯(lián)性。 無(wú)菌檢驗(yàn)：包括從測(cè)試環(huán)境和無(wú)菌灌裝過(guò)程中回收的任何微生物都應(yīng)進(jìn)行物種鑒定。 非無(wú)菌產(chǎn)品：超過(guò)閾值，對(duì)有害生物進(jìn)行初步篩查是非常有必要的。并非所有非無(wú)菌產(chǎn)品都類(lèi)似，因?yàn)轱L(fēng)險(xiǎn)取決于水活度等關(guān)鍵因素。當(dāng)水活度低于大多數(shù)微生物不能生長(zhǎng)的點(diǎn)（例如Aw＜0.6）時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低；但當(dāng)Aw≥0.8時(shí)，鑒定的重要性和對(duì)準(zhǔn)確性要求增加（這取決于產(chǎn)品特定的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估）。對(duì)于0.9及以上的水分活度，建議對(duì)所有高頻的微生物進(jìn)行鑒定。 微生物群落回顧 通常情況下，對(duì)從指定系統(tǒng)中收集的微生物群落進(jìn)行定期回顧是個(gè)很好的做法。對(duì)這些收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行趨勢(shì)分析并研究非典型模式，了解不同微生物的潛在來(lái)源也有助于調(diào)查微生物的偏差，并有可能發(fā)現(xiàn)： a）可能的污染源。例如，許多革蘭氏陽(yáng)性球菌是人類(lèi)皮膚菌群的一部分，革蘭氏陽(yáng)性桿菌可以通過(guò)設(shè)備和鞋類(lèi)轉(zhuǎn)移到潔凈區(qū)域，革蘭氏陰性桿菌通常與水源相關(guān)。這些特征對(duì)于許多根源分析是很重要的，例如，將污染從表面和中間產(chǎn)品關(guān)聯(lián)，確定是否可能由人員干預(yù)引起污染，或推斷無(wú)菌測(cè)試失敗是由于產(chǎn)品污染還是假陽(yáng)性。 b）鑒定還可以輔助篩查不可接受微生物。微生物對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量屬性的影響將取決于產(chǎn)品的預(yù)期或潛在應(yīng)用，生產(chǎn)方法以及后續(xù)處理。通過(guò)鑒定獲得的信息可用于與產(chǎn)品配方進(jìn)行對(duì)照發(fā)現(xiàn)潛在的問(wèn)題。如果微生物有可能降解產(chǎn)品，降低其穩(wěn)定性，那它也是不可接受的。以下一些因素可以用來(lái)評(píng)估微生物在該過(guò)程中存活的可能性（這些因素首先由Halls提出并由Sutton進(jìn)一步發(fā)展形成清單，該清單并非詳盡無(wú)遺，微生物學(xué)家們都應(yīng)制定自己的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)）: ★pH（細(xì)菌對(duì)不同pH的耐受性遠(yuǎn)高于人體耐受性） ★鹽濃度 ★糖濃度 ★水分 ★溫度 ★時(shí)間 同樣地，這樣的信息一定程度的反映了污染微生物存活或者繁殖的可能性。例如在以下條件下，微生物生存率通常較低： ★低或高pH ★高鹽（高滲） ★高糖（高滲） ★水分少 ★高溫（45°C以上） ★低溫（10°C以下） ★存在冷凍步驟 但是，上述列表中的因素還取決于微生物物種。第二個(gè)清單上的不利條件也可能會(huì)對(duì)于某些特定的微生物來(lái)說(shuō)，是生長(zhǎng)或存活的最佳條件。 c）此外，監(jiān)測(cè)微生物趨勢(shì)的變化可以指示清潔區(qū)域環(huán)境中可能出現(xiàn)的問(wèn)題，例如清潔和消毒標(biāo)準(zhǔn)的降低，可能與操作員技術(shù)或消毒劑制備有關(guān)；產(chǎn)芽孢細(xì)菌的增加可能表明選擇消毒劑或其應(yīng)用方式存在問(wèn)題。 d） 關(guān)于上述問(wèn)題，推薦定期用設(shè)備分離株測(cè)試消毒劑。分析最常見(jiàn)的微生物類(lèi)型或在評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)時(shí)可能對(duì)消毒劑的挑戰(zhàn)更大。 e）選擇用于生長(zhǎng)促進(jìn)測(cè)試的微生物。監(jiān)管期望是用于促進(jìn)生長(zhǎng)測(cè)試微生物培養(yǎng)基的測(cè)試組中包含環(huán)境分離株（或“野生型”）。許多公司將選擇兩到四種微生物，并將其添加到藥典推薦的培養(yǎng)基列表中。在設(shè)定頻率下，根據(jù)微生物群落概貌，在必要時(shí)對(duì)這些生物進(jìn)行審查和替換。 總結(jié) 本文概述了微生物鑒定策略的基礎(chǔ)以及一些可采用的不同類(lèi)型的微生物鑒定技術(shù)。鑒定技術(shù)包括表型和基因型方法。對(duì)于任何微生物鑒定系統(tǒng)，尤其是在對(duì)系統(tǒng)發(fā)育和表型系統(tǒng)進(jìn)行比較時(shí)，通常是基于不同方法和不同數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合的結(jié)果。因此，一些微生物學(xué)家認(rèn)為，正確表征微生物的唯一方法是通過(guò)“多相方法”-多種方法相結(jié)合，例如將表型法和基因型方法相結(jié)合。 無(wú)論選擇哪種鑒定方法，實(shí)驗(yàn)室都必須具有使用該系統(tǒng)的能力，與已知微生物的鑒定保持一致，包括本地分離株，以確保在常規(guī)分析中進(jìn)行的任何鑒定都是有效的。對(duì)分析研究人員而言，應(yīng)該通過(guò)鑒定已知的本地微生物群落和參考微生物來(lái)進(jìn)行日常驗(yàn)證。外包鑒定時(shí)，應(yīng)當(dāng)包括適當(dāng)?shù)募夹g(shù)協(xié)議和質(zhì)量職能部門(mén)批準(zhǔn)的設(shè)施，還應(yīng)當(dāng)考慮授權(quán)問(wèn)題。 在概述微生物鑒定策略時(shí)，本文提供了許多關(guān)于鑒定水平的建議，目的是提供一個(gè)框架，不同的組織可以從中構(gòu)建自己的模式。在制定方法時(shí)，重要的是考慮以下問(wèn)題：鑒定的目的是什么？微生物工作者要了解什么？微生物工作者從結(jié)果中能獲得什么信息？這些問(wèn)題有助于選擇合適的微生物鑒定試驗(yàn)并制定鑒定準(zhǔn)則。 “ 長(zhǎng)按二維碼 吧

人生的無(wú)數(shù)種可能，散落在各個(gè)地方，需要我們?nèi)ミh(yuǎn)走，去發(fā)現(xiàn)。為豐富職工業(yè)余活動(dòng)，加強(qiáng)團(tuán)隊(duì)凝聚力、向心力和戰(zhàn)斗力，浙江天科于5月27日—30日期間開(kāi)展了2023年度療休養(yǎng)活動(dòng)。活動(dòng)組織全體員工前往安徽黃山，欣賞皖南山水，感受當(dāng)?shù)厝宋那閼选? TRAVEL Day 1       5月27日上午八點(diǎn)出發(fā)，一行人驅(qū)車(chē)三小時(shí)后抵達(dá)目的地。在徽州特色佳肴的款待下，大伙兒酒足飯飽，午后一同前往徽州府，走在古色古香的白墻青石間，聆聽(tīng)當(dāng)?shù)貧v史名人典故，品味歷史長(zhǎng)河中曾經(jīng)流行一時(shí)的徽派文化。 TRAVEL Day 2       來(lái)了黃山，當(dāng)然要去爬一爬黃山，感受一下“五岳歸來(lái)不看山，黃山歸來(lái)不看岳”的雄壯氣魄。第二天，大家便興致勃勃地踏上了黃山風(fēng)景區(qū)的征程。       雖然中途有人體力不支，但始終沒(méi)有人打退堂鼓，大家互相鼓勵(lì)，勇往直前，欣賞黃山雄奇險(xiǎn)峻的奇峰異石，氣勢(shì)恢宏的松濤云海，登高望遠(yuǎn)，不枉此行。 跋涉途中四周也不乏繁盛可愛(ài)的生靈萬(wàn)物       一路上大家都熱心地分享背包里帶的礦泉水、零食，互幫互助，幫忙背行李，一起等候掉隊(duì)的朋友，大伙齊心協(xié)力，攜手登峰。 “ 即使耗時(shí)5小時(shí)抵達(dá)山頂酒店時(shí)，大家都已經(jīng)精疲力盡，但也不能錯(cuò)過(guò)山頂恢弘的落日。 TRAVEL Day 3 來(lái)都來(lái)了 不看一場(chǎng)日出好像有點(diǎn)虧       當(dāng)大伙兒都沉浸在夢(mèng)中養(yǎng)精蓄銳時(shí)，日出小分隊(duì)已經(jīng)裹好大衣，打著手電筒，扛著設(shè)備，披星戴月地前往山頂眺臺(tái)了。       結(jié)束山上兩天一夜的行程后，下山開(kāi)啟夜生活的正確打開(kāi)方式——逛屯溪老街和黎陽(yáng)老街，酒吧、冷飲、小吃、夜宵、特產(chǎn)一條街，大家優(yōu)哉游哉地散步鬧市中，好像忘卻了白天登山時(shí)身上的酸痛感。 TRAVEL Day 4       最后一天，我們前往宏村觀賞了徽派建筑，遠(yuǎn)看整潔雅致的白墻黛瓦青石板；近看鱗次櫛比的馬頭墻，精妙細(xì)致的鏤空石雕，栩栩如生的門(mén)楣木雕，在細(xì)節(jié)之處體會(huì)前人的“工匠精神”。       本次療休養(yǎng)活既增進(jìn)了同事間的相互了解，也放松了大家的心情，同時(shí)響應(yīng)“健康中國(guó)”理念，借此機(jī)會(huì)呼吁全體員工加強(qiáng)鍛煉，強(qiáng)健體魄、磨煉意志，未來(lái)繼續(xù)保持良好的身體素質(zhì)和精神面貌，積極投入到日常工作中去。 微信號(hào)｜微生物研究所

DOI：10.1038/s41587-019-0156-5 Published：2019.06.24 IF：45.117   //         細(xì)菌性下呼吸道感染(LRIs)臨床診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)是培養(yǎng)周期長(zhǎng)、敏感性較差，因此無(wú)法在早期指導(dǎo)有針對(duì)性的抗菌治療。相較于培養(yǎng)方式，宏基因組測(cè)序可以更快地鑒定LRI病原體，但是需要一些方法來(lái)去除樣品中存在的大量人類(lèi)DNA。       相關(guān)研究開(kāi)發(fā)了一種用于細(xì)菌性下呼吸道感染(LRI)診斷的宏基因組學(xué)方法，利用將基于皂苷的宿主DNA去除與Nanopore測(cè)序相結(jié)合。該研究首先對(duì)40個(gè)樣品進(jìn)行了可行性分析，方法優(yōu)化后，在另外41個(gè)樣品中進(jìn)行測(cè)試。與培養(yǎng)法相比，此優(yōu)化方法(從樣品到結(jié)果6小時(shí))對(duì)病原體檢測(cè)的敏感性為96.6％，特異性為41.7％，并且可以準(zhǔn)確地檢測(cè)抗生素抗性基因。進(jìn)一步通過(guò)定量PCR和病原體特異性基因分析的確認(rèn)，特異性和靈敏度均提高到100％。 LRIs診斷和治療的迫切性和挑戰(zhàn)       現(xiàn)狀：LRIs在2016年造成全球至少300萬(wàn)人死亡，它們可以細(xì)分為社區(qū)獲得性肺炎(CAP)、醫(yī)院獲得性肺炎(HAP)、支氣管炎、細(xì)支氣管炎和氣管炎。發(fā)病率和死亡率取決于感染部位、病原體和宿主因素。在英國(guó)，CAP導(dǎo)致每年約29,000人死亡；在美國(guó)，HAP導(dǎo)致每年約36,000人死亡。最常見(jiàn)的細(xì)菌性CAP病原體是肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)，最常見(jiàn)的HAP病原體是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，腸桿菌科 (Enterobacterlaceae)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。然而，多種細(xì)菌和病毒病原體可引起LRI，這使得診斷和治療成為一項(xiàng)挑戰(zhàn)。       應(yīng)對(duì)這種挑戰(zhàn)，宏基因組測(cè)序具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，相比于傳統(tǒng)鑒定方法，其具有周期短、對(duì)操作及鑒定人員的技術(shù)水平要求低等優(yōu)勢(shì)，而且宏基因組測(cè)序克服了很多不能培養(yǎng)的微生物的弊端，被越來(lái)越多地應(yīng)用于微生物鑒定中，特別是未知病原微生物的鑒定。目前主流的宏基因組測(cè)序方法主要是高通量測(cè)序方法，包括二代和三代測(cè)序。相較于二代測(cè)序鑒定存在從樣本到結(jié)果的周期較長(zhǎng)，測(cè)序讀長(zhǎng)短等問(wèn)題，三代測(cè)序(如Nanopore測(cè)序)具有快速文庫(kù)制備和實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集的優(yōu)勢(shì)。       利用抗生素治療：嚴(yán)重LRI的初始治療通常包括經(jīng)驗(yàn)性廣譜抗生素。鑒于許多患者感染了易感細(xì)菌或病毒，廣泛地“盲目”使用廣譜抗生素是浪費(fèi)，并且構(gòu)成了不良的管理?？咕委煏?huì)破壞腸道菌群，并可能導(dǎo)致耐藥細(xì)菌和艱難梭菌的出現(xiàn)。Nanopore宏基因組學(xué)可以快速準(zhǔn)確地表征細(xì)菌LRI，減少過(guò)量使用廣譜抗生素。       病原體的識(shí)別：此外，“黃金標(biāo)準(zhǔn)”培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)太慢，周期較長(zhǎng)，通常為48-72小時(shí)，并且臨床敏感性低。分子手段可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)識(shí)別病原體及其抗生素耐藥性，實(shí)現(xiàn)早期靶向治療并支持抗生素管理。       數(shù)據(jù)分析優(yōu)勢(shì)：雖然核酸擴(kuò)增試驗(yàn)(包括PCR)是快速且高度特異性/敏感性的，但多重化存在限制，并且還不斷需要更新基于PCR的方法以應(yīng)對(duì)新出現(xiàn)的抗性基因和突變?；诤昊蚪M測(cè)序的方法有可能通過(guò)將速度與所有存在的微生物的全面覆蓋相結(jié)合來(lái)克服培養(yǎng)和PCR的缺點(diǎn)。新一代測(cè)序平臺(tái)，如Ion Torrent和Illumina，被廣泛用于宏基因組測(cè)序，但它們需要在分析開(kāi)始之前完成測(cè)序運(yùn)行(盡管一種最近報(bào)導(dǎo)的LiveKraken能夠在運(yùn)行結(jié)束之前分析原始Illumina數(shù)據(jù))。Nanopore具有快速文庫(kù)制備和實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集的優(yōu)勢(shì)。       無(wú)論是二代測(cè)序還是三代測(cè)序，在大多數(shù)的臨床樣本中，往往存在大量宿主DNA，病原體DNA只占很少一部分，因此，得到的測(cè)序數(shù)據(jù)中只有很小的一部分能夠用于物種和耐藥基因的鑒定，并且從大量的原始數(shù)據(jù)中通過(guò)生信方法，過(guò)濾掉宿主序列需要大量的計(jì)算能力且耗時(shí)很長(zhǎng)，也會(huì)影響臨床樣本中低豐度病原體鑒定的敏感性。       Nanopore測(cè)序已被用于從臨床樣品中靶向鑒定病毒和細(xì)菌病原體，由于共生呼吸道菌群的存在以及宿主：病原體核酸的高比例(痰液中高達(dá)105:1)，呼吸道樣本對(duì)宏基因組測(cè)序提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。Nanopore測(cè)序先前已用于兩個(gè)沒(méi)有去除宿主DNA的細(xì)菌性肺炎患者的樣本，但絕大多數(shù)讀數(shù)是人類(lèi)來(lái)源的，只有一個(gè)和兩個(gè)讀數(shù)分別比對(duì)上感染的病原體-銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。通過(guò)去除宿主DNA，或許可以改善宏基因組學(xué)方法。雖然商業(yè)試劑盒和已發(fā)表的方法可用于去除宿主DNA，但是它們?cè)趶?fù)雜呼吸道樣本中表現(xiàn)不佳，需要更好的方法。本研究提出了一種基于皂苷的Nanopore快速診斷方法，從臨床呼吸道樣本中去除高達(dá)99.99％的宿主核酸，并在6小時(shí)內(nèi)識(shí)別病原體和抗生素抗性基因。 Tips：膽甾醇又稱(chēng)膽固醇，是動(dòng)物組織細(xì)胞所不可缺少的重要物質(zhì)，參與形成細(xì)胞膜，皂苷與膽甾醇結(jié)合生成不溶性分子復(fù)合物，從而破壞細(xì)胞的滲透性而發(fā)生崩解，實(shí)現(xiàn)宿主DNA的游離。       呼吸道樣本宏基因組學(xué)工作流程包括：宿主DNA去除、微生物DNA提取、文庫(kù)制備、MinION測(cè)序和實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1) 方法適用性測(cè)試： 對(duì)來(lái)自40名疑似細(xì)菌LRI患者的呼吸道樣本進(jìn)行了試驗(yàn)方法的測(cè)試。 5個(gè)樣本中(額外)檢測(cè)到未通過(guò)常規(guī)臨床微生物培養(yǎng)的其他病原體：P8、P14、P22、P29、P30；(紅) 3個(gè)樣本中未檢測(cè)到使用常規(guī)臨床微生物培養(yǎng)的病原體：P3、P37、P34。(藍(lán)) 該方法靈敏度為91.4％，特異性為100％，靈敏度和特異性計(jì)算 Clinical Calculator 1 http://vassarstats.net/clin1.html 2) 宏基因組學(xué)優(yōu)化： 兩個(gè)培養(yǎng)陽(yáng)性的痰液樣品用于優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，一個(gè)含有金黃色葡萄球菌和一個(gè)含有銅綠假單胞桿菌。       a. DNA 提?。阂霕悠奉A(yù)處理步驟——磁珠研磨，以優(yōu)化裂解，去除第二次DNA酶處理并減少洗滌次數(shù)將宿主DNA去除方案從90分鐘縮短至50分鐘，而不影響效率。       b. 文庫(kù)工作：通過(guò)將文庫(kù)制備PCR延伸時(shí)間從6mins減少到4mins，通過(guò)4分鐘和6分鐘延伸時(shí)間產(chǎn)生的文庫(kù)之間的微生物群落譜(具有≥0.5％分類(lèi)讀數(shù)的生物)的比較顯示，在金黃色葡萄球菌樣品中，群落中的次要成員的豐度僅有微小差異，并且平均閱讀長(zhǎng)度略微減少。 優(yōu)化方法：在DNA測(cè)序前，將時(shí)間周期縮短至4h以內(nèi)。 3) 檢測(cè)限度： 該方法的檢出限為103-105CFU/ml LoD如何計(jì)算？ 使用未感染的“正常呼吸道菌群”(NRF)的痰液樣品(高和低共生菌群背景各三個(gè)重復(fù))，在已知的細(xì)胞密度下加入連續(xù)十倍稀釋的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養(yǎng)物。如果存在≥1％的分類(lèi)微生物讀數(shù)，則每個(gè)重復(fù)被定義為'病原體'陽(yáng)性(從分析中刪除了WIMP分配中q-score <20的低質(zhì)量讀取比對(duì))。 在高細(xì)菌背景下，大腸桿菌的LoD(≥2/3重復(fù)陽(yáng)性)被確定為100,000(105) CFU/ml，金黃色葡萄球菌的為10,000(104) CFU/ml。 在具有較低細(xì)菌背景的痰樣品中，LoD較低(103金黃色葡萄球菌和大腸桿菌)。 4) 模擬菌群檢測(cè)： 模擬群落由呼吸道樣品的臨床分離株包括 S. pneumoniae, K. pneumoniae, H.influenzae, S. maltophilia and P. aeruginosa組成， 還包括大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌株(分別為H141480453和NCTC 6571)。分別培養(yǎng)之后，將其混入正常痰液樣本中進(jìn)行模擬群落分析，結(jié)果表明：基于皂苷的宿主DNA去除方法不會(huì)無(wú)意中從常見(jiàn)的呼吸道病原體中去除DNA，除了肺炎鏈球菌(平均損失5.7倍)。解釋?zhuān)悍窝祖溓蚓?xì)胞可能在宿主DNA去除過(guò)程中裂解，或者是進(jìn)行模擬群體實(shí)驗(yàn)時(shí)可能已經(jīng)生長(zhǎng)至靜止期而裂解。 5) 優(yōu)化方法測(cè)試： 與培養(yǎng)相比，優(yōu)化方法靈敏度為96.6％，特異性為41.7％。從樣品到結(jié)果的時(shí)間約為6小時(shí)，包括2小時(shí)的MinION測(cè)序。 a. 在8個(gè)樣品中，檢測(cè)到了除培養(yǎng)陽(yáng)性之外的病原微生物：K. pneumoniae in S5, P. aeruginosa in S7, M. catarrhalis in S14 and S39, S. pneumoniae in S8 and S15, S. aureus in S29 and S. pyogenes in S27； b. 7個(gè)樣品中，培養(yǎng)結(jié)果為NRF/無(wú)顯著生長(zhǎng)(NSG)，檢測(cè)到多達(dá)兩種潛在致病菌：H. influenzae and S. pneumoniae in S10 and S21; S. pneumoniae in S11 and S28; M. catarrhalis and H. influenzae in S12; H. influenzae in S31 and E. coli in S32； c. 4個(gè)樣品中，培養(yǎng)方法鑒定出兩種病原微生物混合感染，使用優(yōu)化的方法S9僅檢到一種病原微生物，而S27、S38、S41均準(zhǔn)確檢測(cè)到兩種病原微生物。 使用基于病原體特異性探針的qPCR測(cè)定了不一致的結(jié)果，其增加了靈敏度(100％)和特異性(83.3％):       a. 通過(guò)qPCR證實(shí)了宏基因組學(xué)檢測(cè)到的大多數(shù)其他病原體(19個(gè)中的12個(gè))，這使得優(yōu)化方法的特異性增加到83.3％       b. qPCR對(duì)銅綠假單胞菌(S9)呈陰性，將靈敏度提高至100％。 最后還有7個(gè)樣本結(jié)果存在不一致，其中5個(gè)樣本均為流感嗜血桿菌或肺炎鏈球菌是陽(yáng)性的。猜測(cè)：由于基于kmer的讀取分類(lèi)在種的水平上可能是不可靠的，特別是當(dāng)一個(gè)屬中的物種高度相關(guān)或具有共享基因時(shí)，這些假陽(yáng)性檢測(cè)很可能是由WIMP對(duì)讀數(shù)的錯(cuò)誤分類(lèi)引起的，為了克服這個(gè)問(wèn)題，該研究進(jìn)行了所有流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌陽(yáng)性樣本的pathobiont特異性基因分析(siaT和ply特異性基因分別來(lái)源于相應(yīng)的參考文獻(xiàn)中，使用minimap中的long reads數(shù)據(jù)的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)qualimap對(duì)比對(duì)上的reads進(jìn)行量化，如果樣本中包含1個(gè)以上的特異基因的拷貝，那即為陽(yáng)性)。該分析證實(shí)，假陽(yáng)性結(jié)果(n=5)是由k-mer錯(cuò)誤分類(lèi)引起的，并且與培養(yǎng)+qPCR金標(biāo)準(zhǔn)相比，宏基因組學(xué)測(cè)試靈敏度和特異性為100％。 病原特異性基因分析： 6) 抗生素抗性： 為了最大化對(duì)患者管理的影響，需要鑒定臨床相關(guān)的抗生素抗性基因以及感染病原體。在這方面，目前的宏基因組學(xué)方法具有潛力但仍需要改進(jìn)。 利用ARMA進(jìn)行抗性基因分析，數(shù)據(jù)庫(kù)為CARD，共檢測(cè)到的183個(gè)抗性基因： 26：培養(yǎng)微生物固有的基因； 24：與所觀察到的表型相吻合； 4：與所觀察到的表型部分吻合； 1：不太可能與所觀察到的表型吻合； 14：由于臨床實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有測(cè)試相關(guān)藥物，因此無(wú)法確認(rèn)任何相關(guān)的耐藥性； 16：與培養(yǎng)的菌株表型不匹配；42個(gè)基因不太可能來(lái)自實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的物種。 42：不太可能來(lái)自實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的物種； 56：可能來(lái)源于正常菌群 所開(kāi)發(fā)的抗性基因檢測(cè)方法的特異性和靈敏度尚未確定，因?yàn)檫@需要對(duì)所有細(xì)菌(病原體和共生體)進(jìn)行分離和測(cè)序—這是一項(xiàng)令人望而卻步的任務(wù)。 7) 根據(jù)參考基因組組裝： 臨床宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)也可用于組裝病原體基因組以供參考實(shí)驗(yàn)室分型。 宿主DNA去除的S16樣品：在測(cè)序的前2小時(shí)內(nèi)，具有47.9倍的基因組覆蓋率，具有28個(gè)contigs，測(cè)序48小時(shí)后，基因組覆蓋率增加至228.7倍，最終組裝由22個(gè)contigs組成； 宿主DNA未去除的S16樣品：在測(cè)序的前2小時(shí)內(nèi)，具有3.9倍的基因組覆蓋率，具有69個(gè)contigs，測(cè)序48小時(shí)后，基因組覆蓋率增加至17.5倍，最終組裝由33個(gè)contigs組成； 宿主DNA去除的S1樣品：在測(cè)序的前2小時(shí)內(nèi)，具有33.5倍的基因組覆蓋率，具有83個(gè)contigs，測(cè)序48小時(shí)后，基因組覆蓋率增加至165.7倍，最終組裝由72個(gè)contigs組成； 宿主DNA未去除的S1樣品：在測(cè)序的前2小時(shí)內(nèi)，具有0.2倍的基因組覆蓋率，測(cè)序48小時(shí)后，基因組覆蓋率增加至1.1倍。 8) 時(shí)間點(diǎn)分析： 通過(guò)此方法生成的宏基因組數(shù)據(jù)的質(zhì)量/深度可以直接從臨床樣本實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)病原體的出現(xiàn)和患者與患者之間的傳播以及抗菌素耐藥性。 在測(cè)序的5分鐘內(nèi)，去除宿主DNA的S16樣品具有1.6倍的基因組覆蓋率，而未去除宿主DNA的對(duì)照的覆蓋度為0.2倍； 5分鐘后在未去除宿主DNA的樣品中未檢測(cè)到mecA基因，而在相同的時(shí)間點(diǎn)在去除宿主DNA的樣品中檢測(cè)到兩個(gè)mecA基因alignments。 在測(cè)序的20分鐘內(nèi)，去除宿主DNA的S1樣品具有5.7倍的基因組覆蓋率，而未去除宿主DNA的對(duì)照的覆蓋度為0.06倍； 在測(cè)序的2小時(shí)內(nèi)未檢測(cè)到未去除宿主DNA的樣品中的blaTEM和dfrA17基因，并且僅檢測(cè)到一個(gè)針對(duì)sul1的alignment。相反，在去除宿主DNA的樣品中在測(cè)序的20分鐘內(nèi)檢測(cè)到所有三種抗性基因，并且在2小時(shí)后，檢測(cè)到47個(gè)blaTEM，37個(gè)sulf1和21個(gè)dfrA17 alignments。 強(qiáng)調(diào)了去除宿主DNA在快速診斷病原微生物和抗性基因中的重要性。 總結(jié) 本研究報(bào)告了利用Nanopore技術(shù)快速(6h)診斷病原體和抗生素抗性基因的宏基因組學(xué)流程。此外，通過(guò)額外的測(cè)序時(shí)間(最多48h)，可以為公共健康和感染控制應(yīng)用提供足夠的數(shù)據(jù)。 往期閱讀推薦 [1] 制藥設(shè)施老化的風(fēng)險(xiǎn)分析 [2] 霉菌和酵母到底怎么分？ [3] 流感病毒如何做到每年打卡脆弱的人類(lèi) [4] 水系統(tǒng)中的細(xì)菌共聚集現(xiàn)象（生物膜） [5] 突擊檢查！細(xì)菌拉丁名雙名法規(guī)則 微生物研究所 微信公眾號(hào) | 微生物研究所 掃二維碼關(guān)注我們哦~

伴隨著制藥行業(yè)的不斷發(fā)展，一項(xiàng)新的監(jiān)管問(wèn)題已躍現(xiàn)在人們眼前：與制藥設(shè)施年份相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。 圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò) 在世界各地，許多較為成熟的制藥設(shè)施已度過(guò)了漫長(zhǎng)的歲月，三十年，五十年，甚至更久。相比于藥企追求的新興市場(chǎng)（如中國(guó)、東歐和亞洲等），北美和歐洲等區(qū)域的工廠設(shè)施更為古老，可能需要更多維護(hù)。老化的制藥設(shè)施會(huì)帶來(lái)各種風(fēng)險(xiǎn)，本文將就其中的一部分進(jìn)行討論。并非所有藥企均會(huì)涉及這些風(fēng)險(xiǎn)，部分設(shè)施依然可以正常高效的運(yùn)行，但有多數(shù)設(shè)施將會(huì)需要額外的查驗(yàn)與評(píng)估。 設(shè)施老化會(huì)產(chǎn)生一系列潛在風(fēng)險(xiǎn)，如產(chǎn)能升級(jí)、過(guò)時(shí)、升級(jí)時(shí)間不足、新產(chǎn)品線的推廣、無(wú)法接受革新、微生物污染、監(jiān)管問(wèn)題、知識(shí)儲(chǔ)備、驗(yàn)證狀態(tài)、質(zhì)量體系等多方面，本文將著重介紹可能引起微生物污染的相關(guān)內(nèi)容： 1 設(shè)施管理不善 常用設(shè)施保養(yǎng)不足，導(dǎo)致油漆剝落或外殼破碎，會(huì)為微生物的滋生提供溫床。芽孢桿菌屬和真菌等產(chǎn)生芽孢和孢子的幾率增大。 芽孢桿菌 圖片來(lái)源：環(huán)境微生物圖譜 2 改變?cè)O(shè)施使用方法 人員和設(shè)備使用的改變會(huì)帶來(lái)潛在風(fēng)險(xiǎn)。例如專(zhuān)為特定人數(shù)和操作水平人員設(shè)計(jì)的設(shè)施，考慮到人員是潔凈室環(huán)境下的主要污染源，如果超過(guò)原本的限度，可能會(huì)給污染控制帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。 圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò) 此外，生產(chǎn)設(shè)備和布局的變更會(huì)改變氣流方向，特別是會(huì)對(duì)無(wú)菌處理造成影響。增加的設(shè)備會(huì)在工作空間中產(chǎn)生更多熱量，添加的空調(diào)會(huì)造成更多熱負(fù)荷。如果未適當(dāng)控制環(huán)境，可能會(huì)導(dǎo)致人員脫落更多的皮膚，從而加重潔凈室的微生物負(fù)載。另一方面，隨著設(shè)備數(shù)量的增加，由于操作人員無(wú)法在設(shè)備周?chē)l繁移動(dòng)，會(huì)使工作區(qū)域更加難以清潔和消毒?？諝饬魍ú涣歼€會(huì)帶來(lái)其他風(fēng)險(xiǎn)，例如一些難以發(fā)現(xiàn)的真菌等。 3 結(jié)構(gòu)碎片 墻體裂隙、塑料碎片、伸縮縫性能退化都可能導(dǎo)致微生物污染事件。這些潔凈室中暴露的不清潔區(qū)域，會(huì)成為微生物居住的巢穴。因?yàn)榍鍧嵎桨竿鶡o(wú)法深入處理這些裂縫。 圖片來(lái)源：原文獻(xiàn) 另一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)是脆弱或破損的碎片的會(huì)隨著高速氣流從工廠區(qū)域進(jìn)入潔凈室。這可能導(dǎo)致多種氣流混合以及污染爆發(fā)的潛在后果。 定期檢查和完善的維護(hù)程序可以克服這些問(wèn)題，同時(shí)可以安裝壓縮橡膠墊圈等高質(zhì)量密封件加以預(yù)防。 4 建筑空隙 相鄰的潔凈室或者潔凈室與外界之間存在空隙，這些空隙會(huì)積聚灰塵，在灰塵中則會(huì)存在許多產(chǎn)孢微生物。這樣的環(huán)境如果在設(shè)施改造時(shí)受到干擾，例如為擴(kuò)大潔凈室面積而砸穿一堵墻，就可能引起微生物污染。在改造設(shè)施時(shí)實(shí)行良好的控制措施，包括合理分區(qū)以及定期清潔和吸塵等，然后定期殺孢消毒。 圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò) 在日常運(yùn)行時(shí)，老化的設(shè)施需要安排更多的查驗(yàn)項(xiàng)目，尋找損壞、裂縫、漏水等情況，相對(duì)而言，資源更傾向于有計(jì)劃的預(yù)防性維護(hù)。此外還需加強(qiáng)環(huán)境監(jiān)測(cè)，以確保盡早發(fā)現(xiàn)污染問(wèn)題并加以解決。 參考文獻(xiàn) Shanley, A. Aging Facilities: Aseptic Manufacturing Faces The Future, Pharmaceutical Technology, 2015; 39(14): 4-11 Sandle, T. The Risk of Bacillus cereus to Pharmaceutical Manufacturing, American Pharmaceutical Review, 2014; 17 (6): 1-6 Sandle, T. People in Cleanrooms: Understanding and Monitoring the Personnel Factor, Journal of GXP Compliance, 2014; 18 (4): 1-5 Sandle, T. Making the grade in filters, Cleanroom Technology, 2012, 20 (12): 19-20 Sandle, T. Risk Consideration for Aging Pharmaceutical Facilities, ResearchGate, 2016 at:https://www.researchgate.net/publication/303820898 往期閱讀推薦 [1] 霉菌和酵母到底怎么分？ [2] 流感病毒如何做到每年打卡脆弱的人類(lèi) [3] 水系統(tǒng)中的細(xì)菌共聚集現(xiàn)象（生物膜） [4] 突擊檢查！細(xì)菌拉丁名雙名法規(guī)則 微生物研究所 微信公眾號(hào) | 微生物研究所 掃二維碼關(guān)注我們哦~

真菌，是我們生活中最最常見(jiàn)的微生物，潮濕天氣墻角的白毛，水果放久了表面的霉變，還有雨后從石頭縫里長(zhǎng)出來(lái)的小蘑菇，都屬于真菌。真菌，百度百科里講，是一種具真核的、產(chǎn)孢的、無(wú)葉綠體的真核生物。 常常有人來(lái)問(wèn)，某某真菌屬于霉菌還是酵母??？今天我就來(lái)盤(pán)點(diǎn)下這些真菌各自的區(qū)別。 酵母菌 真菌是真核異養(yǎng)生物，目前主要分為酵母菌、絲狀真菌，也就是大家所知的霉菌以及蕈菌。酵母菌（yeasts）是一類(lèi)真菌微生物的俗稱(chēng)，并不是專(zhuān)業(yè)的分類(lèi)名詞，目前大約有1500種，大部分屬于Ascomycota門(mén)，少部分為Basidiomycota門(mén)。由于酵母菌有很多的例外，所以甚至很難對(duì)它下確切的定義。一般我們認(rèn)為，酵母有以下5個(gè)特征： 1）個(gè)體一般以單細(xì)胞狀態(tài)存在； 2）多數(shù)以出芽方式繁殖，也有的可行裂殖或產(chǎn)子囊孢子； 3）能發(fā)酵糖類(lèi)而產(chǎn)能； 4）細(xì)胞壁常含甘露聚酶； 5）喜歡在含糖較高、酸性的水生環(huán)境中生長(zhǎng)。 酵母菌 （圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)） 酵母的蛋白含量較高，菌體蛋白與牛肉等蛋白的氨基酸組成基本相近，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，如果荒野求生中貝爺能找到合適的酵母菌，說(shuō)不定能不用吃昆蟲(chóng)了~扯遠(yuǎn)了。酵母菌廣泛分布在自然界中，比如果品、蔬菜、花蜜和植物葉子表面，葡萄園等果園的土壤是篩選酵母菌的好去處。 酵母菌一般為單細(xì)胞，通常菌體呈圓形、卵形或者橢圓形，比細(xì)菌粗10倍，直徑一般2-5μm，長(zhǎng)5-30μm。酵母的繁殖方式有很多種，分為有性繁殖和無(wú)性繁殖：有性繁殖主要是產(chǎn)子囊孢子，例如酵母屬（Saccharomyces）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces），無(wú)性繁殖包括芽殖（各種酵母菌都存在）、裂殖（Schizosaccharomyces）和產(chǎn)生無(wú)性孢子，無(wú)性孢子例如節(jié)孢子（地霉屬Geotrichum）、擲孢子（擲孢酵母菌屬 Sporobolomyces）、厚坦孢子（白色念珠菌 Candida albicans）等。 霉菌 霉菌（Mold）與酵母菌都屬于真菌界，跟酵母菌一樣，霉菌也是個(gè)俗稱(chēng)，一般指那些菌絲發(fā)達(dá)又不產(chǎn)生大型肉質(zhì)子實(shí)體結(jié)構(gòu)的真菌，他們通常分屬真菌界的藻狀菌綱、子囊菌綱、未知菌類(lèi)。 霉菌能形成無(wú)數(shù)個(gè)孢子，漂浮于空氣中，隨風(fēng)到處散布，有人測(cè)定巴黎市中心空氣中的真菌孢子數(shù)目，每升空氣中大約有2000個(gè)真菌孢子。霉菌菌體均由分枝或不分枝的菌絲構(gòu)成，菌絲是營(yíng)養(yǎng)體的基本單位，許多菌絲連接交織在一起成為菌絲體。菌絲可以是單細(xì)胞，即沒(méi)有隔膜，也可以是多細(xì)胞，即有分隔，霉菌菌絲直徑2-10μm，比桿菌、放線菌的菌絲寬幾倍到十幾倍。 霉菌 （圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)） 霉菌菌落質(zhì)地較放線菌疏松，外觀干燥不透明。菌落和培養(yǎng)基之間連接緊密，菌落邊緣與中心，正面與反面的顏色往往不一致。最常見(jiàn)的霉菌包括青霉、曲霉等。曲霉屬在各種環(huán)境中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾百個(gè)物種，從顯微鏡中看到，形態(tài)像花灑（aspergillum），所以取名叫Aspergillus。曲霉屬真菌是一類(lèi)具有分生孢子的真菌。是常見(jiàn)的淀粉類(lèi)食物(如面包和土豆)的污染物，也能生長(zhǎng)在許多植物和樹(shù)木中。曲霉菌真菌可以在高滲透壓的環(huán)境中生存，也可以在營(yíng)養(yǎng)缺乏的環(huán)境中生存。青霉屬為多細(xì)胞，菌絲有分隔，有分枝。分生孢子藍(lán)綠色，能耐低濕度、高滲透壓的環(huán)境。 表1 酵母菌與霉菌的比較 蕈菌 既然酵母菌和霉菌都講了，那就順道講講蕈菌。蕈菌包括了大多數(shù)擔(dān)子菌和極少數(shù)的子囊菌。擔(dān)子菌綱是真菌中最高級(jí)的一個(gè)綱，我們常見(jiàn)的蘑菇、木耳，以及云南人愛(ài)吃的那些菌子們，通通屬于這一類(lèi)，這可比霉菌酵母好認(rèn)多了。它們的特征，就是“擔(dān)子”，“擔(dān)子”其實(shí)是一個(gè)特殊的產(chǎn)孢器，可以用來(lái)產(chǎn)生擔(dān)孢子。擔(dān)子菌的菌絲發(fā)育較好，并且有分隔，可以擴(kuò)展生成扇形，菌絲體具有三個(gè)明顯的發(fā)育階段：初生菌絲、二生菌絲和三生菌絲。 初生菌絲為單倍體，由擔(dān)孢子萌發(fā)而成。 二生菌絲為雙核體，由2個(gè)單核細(xì)胞進(jìn)行異宗配合而成。 三生菌絲也是雙核體，由二生菌絲特化而來(lái)，從而形成各種子實(shí)體。當(dāng)然，擔(dān)子菌的繁殖也是有無(wú)性生殖和有性生殖兩種的。需要提一句的是，雖然我們認(rèn)為的擔(dān)子菌大多數(shù)都是蘑菇類(lèi)型的，但是在它還是初生菌絲、二生菌絲的時(shí)候，也可以飄到平板上被我們檢出。 蕈菌 （圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)） 講了那么多，你對(duì)霉菌和酵母會(huì)區(qū)分了嗎？ 不會(huì)三者分不清了吧，其實(shí)蕈菌還是相對(duì)好區(qū)分的，畢竟大多數(shù)蕈菌都是擔(dān)子菌綱的，通過(guò)天科ITS/D2真菌鑒定方法鑒定出來(lái)物種查查它的分類(lèi)，就可以大體區(qū)分出來(lái)啦~ 實(shí)在搞不定的 那請(qǐng)務(wù)必繼續(xù)來(lái)問(wèn)我們哈~ 我們會(huì)想辦法幫忙查資料的 往期推薦 [1] 流感病毒如何做到每年打卡脆弱的人類(lèi) [2] 水系統(tǒng)中的細(xì)菌共聚集現(xiàn)象（生物膜） [3] 突擊檢查！細(xì)菌拉丁名雙名法規(guī)則 [4] 【科普動(dòng)畫(huà)】耳朵越掏越上頭，可要警惕這種菌——小M護(hù)耳記

最新資訊 據(jù)國(guó)家流感中心3月29日發(fā)布的最新監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示： 2023 年第 12 周（截至3月26日），全國(guó)（未含港澳臺(tái)地區(qū)，下同）流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室共檢測(cè)流感樣病例監(jiān)測(cè)標(biāo)本13305 份。南、北方省份檢測(cè)到的流感各型別及亞型的數(shù)量如下表所示。 表1 流感樣病例監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果 國(guó)家流感中心對(duì)144株 A(H1N1)pdm09 亞型流感毒株進(jìn)行抗原性分析，其中144株（100%）為 A/Victoria/2570/2019 的類(lèi)似株。 根據(jù)近幾期的流感報(bào)告結(jié)果顯示，這波來(lái)勢(shì)洶洶的流感病毒有A型和B型兩種，并以A型感染為主，包括H1N1和H3N2兩種亞型。近期隨著新冠疫情逐漸淡出人們的視線，不經(jīng)意間流感病毒猛地沖上了一波高潮，雖然既往每年都會(huì)出現(xiàn)季節(jié)性流感高峰，但今年的甲流自2月底開(kāi)始，到3月中旬以來(lái)持續(xù)處于高峰，與往年相比不但爆發(fā)時(shí)間遲，而且發(fā)病率也更高，引起了社會(huì)的廣泛重視。面對(duì)盛行的甲流，有人表示流感盛行數(shù)十年，早已習(xí)以為常，從來(lái)不帶怕的；也有中招的網(wǎng)友親測(cè)表明感染甲流比新冠還受虐，一度誤以為是新冠二次感染。 表2 我國(guó)近期流感數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表 將最近7周的流感數(shù)據(jù)匯總后，可以看到本周報(bào)告的陽(yáng)性數(shù)有所下降，但實(shí)際上檢測(cè)到的南方省份流感樣病例百分比依然呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，不同于北方省份自第11周開(kāi)始已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。因此，“甲流熱潮”仍未完全退散，大家還是得保護(hù)好自己，不能讓甲流逮到可乘之機(jī)。 每年復(fù)出即占據(jù)熱搜的“流行性感冒病毒”真有這么“潮”嗎？ 實(shí)際上，流感病毒還真是持續(xù)在“迭代更新”的，不斷引起流行的原因，是其抗原性在不斷發(fā)生變異，自2009年被發(fā)現(xiàn)并命名以來(lái)，已經(jīng)出現(xiàn)了眾多類(lèi)型，只不過(guò)統(tǒng)稱(chēng)為“流感”。所以這一期我們就來(lái)剖一剖流感病毒，了解一下這類(lèi)病原體。 圖1 流感病毒的3D圖像 （圖片來(lái)源：美國(guó)CDC官網(wǎng)） 流感病毒的形態(tài) 圖2 高倍放大的數(shù)字彩色投射電子顯微鏡（TEM）圖像下的H1N1分離株病毒成像形態(tài) （圖片來(lái)源：美國(guó)CDC官網(wǎng)） 流感病毒屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae）家族，是負(fù)鏈單鏈RNA（-ssRNA）病毒，具有多形態(tài)，有的呈絲狀、有的呈桿狀，但一般為球形，病毒的直徑為80～120nm，內(nèi)有一直徑約為70nm 的電子致密核心，其實(shí)就是病毒的核衣殼。絲狀體長(zhǎng)短不一，長(zhǎng)度有時(shí)可達(dá)幾微米。 圖3 流感病毒結(jié)構(gòu)示意圖 （圖片來(lái)源：參考文獻(xiàn)） 流感病毒的結(jié)構(gòu)主要包括內(nèi)部的核心（即核衣殼）和外面的包膜（即病毒囊膜）兩部分其中，血凝素 (Hemagglutinin, HA)是由3條糖基化多肽分子以非共價(jià)形式聚合而成的三聚體，神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase, NA）是由4條相同的糖基化多肽所組成的蘑菇狀四聚體，兩者均為表面糖蛋白，分別參與融合宿主細(xì)胞上的受體和侵入細(xì)胞后毒素釋放的過(guò)程；M2離子通道蛋白被埋在來(lái)自宿主質(zhì)膜的病毒包膜中，參與病毒的脫殼過(guò)程；基質(zhì)M1蛋白與核糖核蛋白和病毒包膜相關(guān)。核糖核蛋白復(fù)合體中包括一個(gè)與核蛋白（nuclear protein, NP）相關(guān)的病毒RNA片段和三個(gè)聚合酶蛋白(PA, PB1和PB2)，共同參與病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。 流感病毒的分型 根據(jù)流感病毒核蛋白（nuclear protein, NP）和膜蛋白（membrane protein , MP）抗原決定簇的不同，可分為甲（A）、乙（B）、丙（C）3型，近年來(lái)才發(fā)現(xiàn)的牛流感病毒歸為?。―）型，是否感染人類(lèi)暫未知。其中A型病毒(IAV)和B型病毒(IBV)主要感染人類(lèi)，包含8個(gè)基因片段，編碼16種蛋白質(zhì)。兩者進(jìn)一步的分型是基于血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)表面糖蛋白的抗原性。IBV相對(duì)較簡(jiǎn)單，只有1種HA和NA，沒(méi)有其他亞型。IAV變異性最強(qiáng)，是在世界上流行最廣、致病性最強(qiáng)的病毒，可以感染廣泛的動(dòng)物物種，目前已鑒定出18個(gè)HA (H1-H18)亞型和11個(gè)NA (N1-N11)亞型。 圖4 甲型H1N1流感病毒結(jié)構(gòu)圖 （圖片來(lái)源：美國(guó)CDC官網(wǎng)） 流感病毒的致病性 HA作為IAV中最豐富的表面糖蛋白，具有附著宿主細(xì)胞的能力，引起細(xì)胞融合和病毒進(jìn)入。HA的高度可變性使IAV逃脫宿主免疫監(jiān)測(cè)，并導(dǎo)致流感季節(jié)性流行。NA是第二豐富的糖蛋白，可切割唾液酸（sialic acid，SA）部分，促進(jìn)新生病毒粒子的釋放，并促進(jìn)IAV的分散。流感病毒依靠宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制的具體步驟如下圖所示。  vRNA：病毒RNA；cRNA：互補(bǔ)RNA 圖5 流行性感冒（流感）病毒復(fù)制周期 （圖片來(lái)源：參考文獻(xiàn)） HA與細(xì)胞表面的唾液酸受體結(jié)合后，病毒顆粒被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，形成內(nèi)吞體。此時(shí)，離子通道蛋白M2被激活，離子通道打開(kāi)，允許H+進(jìn)入病毒；pH值降低到5.0時(shí)，內(nèi)吞體膜與病毒包膜融合，病毒粒子中的病毒 RNA（viralRNA，vRNA）被釋放到細(xì)胞質(zhì)中（脫殼）。vRNA與RNA依賴性 RNA 聚合酶（RNA- dependent RNA polymerase，RdRp）被輸運(yùn)到細(xì)胞核進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。合成的RNA不含mRNA所必需的帽子（Cap）結(jié)構(gòu)，RdRp 的 Cap 依賴性內(nèi)切酶將宿主 mRNA 的 Cap結(jié)構(gòu)切除并轉(zhuǎn)移到 vRNA 上，形成病毒 mRNA（搶帽反應(yīng)）。vRNA 被轉(zhuǎn)錄成 mRNA，用于產(chǎn)生病毒蛋白，并通過(guò)互補(bǔ)RNA（complementary RNA，cRNA）進(jìn)行復(fù)制。病毒蛋白和 RdRp-RNA 復(fù)合體形成病毒顆粒，隨后從細(xì)胞膜上出芽。從細(xì)胞表面生長(zhǎng)出來(lái)的病毒顆粒上的 HA 與被感染細(xì)胞表面的 SA 受體結(jié)合，NA 通過(guò)水解 SA 受體釋放出病毒顆粒，成為具有感染力的新病毒。 IAV會(huì)感染氣管、支氣管和肺泡，并破壞上皮細(xì)胞。因此，病毒擴(kuò)散到下呼吸道并造成組織損傷的能力是致命的關(guān)鍵因素。大多數(shù)死亡病例還患上了細(xì)菌性肺炎。目前公認(rèn)呼吸衰竭的主要原因是并發(fā)細(xì)菌性肺炎導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。其特征是破壞肺泡的內(nèi)皮-上皮屏障，導(dǎo)致液體泄漏并積聚在肺泡腔內(nèi)，抑制氣體交換。 流感病毒的變異 流感病毒能不斷引起流感流行是因?yàn)槠淇乖圆粩喟l(fā)生變異，HA 和NA 是其主要的變異基因，HA 變異最快，其次是 NA。HA 基因分子中受體結(jié)合部位、糖基化位點(diǎn)及連接肽氨基酸發(fā)生替換常造成流感病毒株的致病性和宿主范圍的改變。NA 基因的神經(jīng)氨酸酶活性位點(diǎn)的變異會(huì)導(dǎo)致酶活性的改變甚至喪失，導(dǎo)致病毒繁殖能力的下降。流感病毒主要通過(guò)抗原位點(diǎn)上氨基酸變異和HA 糖基化的方式逃避宿主中和抗體的免疫壓力,使疫苗不能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有效的保護(hù)，從而造成疫苗免疫失敗。 相關(guān)研究對(duì)杭州市2009-2020年期間A(H1N1)pdm09病毒的流行情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，并隨機(jī)選取覆蓋12個(gè)連續(xù)監(jiān)測(cè)年度、10次流行高峰的208株代表性流行株進(jìn)行血凝素基因(HA)全序列測(cè)定，分析其基因變異情況并繪制系統(tǒng)發(fā)育特征圖如下所示。 圖6 2009—2020年杭州地區(qū)A（H1N1）pdm09亞型流感病毒HA基因的系統(tǒng)發(fā)育特征分析 （圖片來(lái)源：參考文獻(xiàn)） 結(jié)果顯示在2009—2020 年連續(xù)12個(gè)監(jiān)測(cè)年度里杭州地區(qū)的A（H1N1）pdm09流行株主要由Group1、5、6、7四個(gè)支系組成，其中Group6支系的流行最為廣泛和持久。隨著病毒的遺傳變異，Group6支系分化為6A、6B（優(yōu)勢(shì)株）和6C，其中6B又衍生出6B.1和6B.2。小支系6B.1進(jìn)一步分化出6B.1A，其攜帶S74R、S164T和1295V等多個(gè)氨基酸突變特征，成為2017年后流行的A(H1N1)pdm09病毒絕對(duì)優(yōu)勢(shì)株。6B.1A小支系在2017/2018冬春流行季之后再次分化為均攜帶S183P氨基酸突變的6B.1A1、6B.1A5和6B.1A6，并繼續(xù)在本地廣泛流行。 流感基因組測(cè)序方法 事實(shí)上所有的流感病毒都會(huì)隨著時(shí)間的推移發(fā)生基因變化，由于流感病毒不斷變化的性質(zhì)，從患者身上收集的許多流感病毒彼此之間也具有微小的遺傳差異。此前，研究者使用Sanger測(cè)序技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)流感的演變，作為基因表征的一部分。Sanger測(cè)序能夠體現(xiàn)病毒樣本中毒株的主要基因序列，但無(wú)法呈現(xiàn)樣本中病毒數(shù)量的微小變化。而采用二代測(cè)序檢測(cè)技術(shù) (next-generation sequencing，NGS)，則大大擴(kuò)展了測(cè)序分析可以提供的信息量和細(xì)節(jié)，能夠檢測(cè)到病毒基因的微小變異，并為全基因組測(cè)序提供了優(yōu)勢(shì)，流感病毒由單鏈RNA組成，通過(guò)全基因組測(cè)序可以揭示流感病毒基因組中大約13500個(gè)核苷酸(即A、C、G和U)序列。NGS使用先進(jìn)的分子檢測(cè)技術(shù)(AMD)來(lái)識(shí)別樣本中每種病毒的基因序列。因此，NGS揭示了單個(gè)樣本中許多不同流感病毒顆粒之間的遺傳變異，并可以提高病毒每個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)測(cè)序的速度和準(zhǔn)確性，對(duì)流感病毒基因變異情況的分析及對(duì)流感的預(yù)測(cè)、防控、診斷都具有重要意義。 參考文獻(xiàn)： [1]. 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不少朋友可能享受掏耳朵帶來(lái)的快感，隔三差五地用棉簽或者掏耳勺清理耳朵，感覺(jué)解壓又上頭，殊不知過(guò)度的清潔反而會(huì)破壞耳道的防護(hù)屏障，給病菌帶來(lái)可乘之機(jī)。 這一期就讓我們走進(jìn)微生物科普系列動(dòng)畫(huà)短片第二集《小M護(hù)耳記》，來(lái)看看愛(ài)好朋克裝扮的暗黑首領(lǐng)——黑曲霉（Aspergillus niger），是如何在外耳道內(nèi)“掀風(fēng)作浪”的吧。 ，時(shí)長(zhǎng)04:45 PS：本視頻為浙江省藥檢院與我所合作制作的微生物科普系列視頻第二集，未經(jīng)許可，請(qǐng)勿轉(zhuǎn)載。         黑曲霉是曲霉屬真菌中的一個(gè)種，在生活中像一把“雙刃劍”影響著我們的日常。一方面，黑曲霉以其極端環(huán)境耐受性、高生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性、強(qiáng)發(fā)酵魯棒性與高食品安全性等優(yōu)勢(shì)而具有較高的應(yīng)用價(jià)值，常作為發(fā)酵工業(yè)菌株應(yīng)用于酶制劑和有機(jī)酸的生產(chǎn)。另一方面，黑曲霉被劃分為病原微生物中的第四類(lèi)，即通常情況下不會(huì)引起人類(lèi)或者動(dòng)物發(fā)病，對(duì)個(gè)體危害和群體危害較低的微生物。但黑曲霉感染后的危害不容小覷，黑曲霉在免疫正常人耳真菌病中是最常見(jiàn)的分離菌，還可導(dǎo)致真菌性角膜炎及肺部感染，此外，在環(huán)境中也是導(dǎo)致食品或其他工業(yè)器材霉變的主要“元兇”之一。 黑曲霉的真實(shí)面目： 黑曲霉菌叢呈黑褐色，頂囊大球形，小梗雙層，分生孢子為球形，呈黑、黑褐色，平滑或粗糙，菌絲發(fā)達(dá)，多分枝。對(duì)紫外線以及臭氧的耐性強(qiáng)。分生孢子梗由特化了的厚黑曲霉壁從膨大的菌絲細(xì)胞（足細(xì)胞）上垂直生出；分生孢子頭狀如“菊花”，蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無(wú)色或中央略帶黃褐色。黑曲霉的菌絲、孢子經(jīng)常呈現(xiàn)各種顏色，如：黑、棕、綠、黃、橙、褐等，菌種不同，顏色也不同。 黑曲霉鏡檢形態(tài)特征 圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò) 臨床上曲霉感染發(fā)生率居系統(tǒng)性真菌感染的第二位，因此快速準(zhǔn)確檢測(cè)和鑒別曲霉具有重要的臨床意義。目前曲霉鑒定方法包括傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定、質(zhì)譜、DNA序列分析等技術(shù)。對(duì)于廣大的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室而言，曲霉的形態(tài)學(xué)鑒別還是目前主要的鑒定手段。 黑曲霉的培養(yǎng)特性： 1. 沙氏瓊脂上生長(zhǎng)快，3d內(nèi)成熟。開(kāi)始為白色絨毛狀，逐漸菌落中央出現(xiàn)很淡的黃色，最后變?yōu)榇纸q狀黑色或黑褐色，背面無(wú)色或淡黃色。 2. 馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，菌落特點(diǎn)接近沙氏瓊脂，菌落表面黑色顆粒較沙氏瓊脂上菌落顆粒粗。 3. 察氏瓊脂上，生長(zhǎng)迅速，質(zhì)地絲絨狀或稍呈絮狀，少數(shù)菌株生長(zhǎng)較局限。表面呈暗褐黑色至炭黑色，反面無(wú)色或淡黃色。察氏瓊脂上菌落相比SDA和PDA，生長(zhǎng)稍慢，菌落表面黑色顆粒稀疏。 4. 在PDA培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)迅速，10-14日直徑可達(dá)25-3cm，菌落初為白色，常有鮮黃色區(qū)域，厚絨狀，繼而黑色，背面無(wú)色或中央部分略帶褐色。 黑曲霉培養(yǎng)菌落特征 圖片來(lái)源：網(wǎng)絡(luò) 黑曲霉屬于黑色曲霉組，當(dāng)黑曲霉需要作為特定菌株進(jìn)行應(yīng)用時(shí)，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒別是難以給出充分的種水平鑒定結(jié)論的。比如黑曲霉與巴西曲霉在形態(tài)學(xué)上非常相似，兩者的鑒定就需要通過(guò)表型分析技術(shù)結(jié)合基因型分析技術(shù)進(jìn)行多相鑒定綜合判斷才能得出正確的鑒定結(jié)果。 基于ITS DNA序列的黑色曲霉N-J樹(shù) 圖片來(lái)源：參考文獻(xiàn) 在2008年，美國(guó)典型菌種保藏中心（ATCC）對(duì)ATCC16404做了復(fù)合鑒定，發(fā)現(xiàn)ATCC16404的表型、基因型與黑曲霉的模式菌株ATCC16888存在差異，而與巴西曲霉的模式菌株完全一致，因此ATCC16404被更名為Aspergillus brasiliensis巴西曲霉。在2010年，美國(guó)藥典（USP）已經(jīng)將ATCC16404由Aspergillus niger黑曲霉改名為Aspergillus brasiliensis巴西曲霉，是USP史上中第一株更名的標(biāo)準(zhǔn)菌株。 近年來(lái)，隨著控制醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)上有害曲霉的控制和工業(yè)上有益曲霉的培養(yǎng)需求加大，黑曲霉相關(guān)高效基因編輯技術(shù)和分類(lèi)研究的不斷深入。有望通過(guò)進(jìn)行基因組改造進(jìn)一步開(kāi)發(fā)黑曲霉的應(yīng)用潛力，更廣泛地應(yīng)用于人們的生產(chǎn)生活。 參考文獻(xiàn) [1] Houseknecht, J., Stamenova, E., Suh, S.-0., et al. Reclassification of ATCC 16404 and ATCC 9642 as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2008, 14: 2-8. [2] 隋雨菲, 歐陽(yáng)立明, 魯洪中, 等. 黑曲霉組學(xué)研究進(jìn)展[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(8): 1010-1025. [2] 徐和平, 黃江山. 臨床常見(jiàn)曲霉形態(tài)學(xué)鑒定[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2017, 35(17): 758-764. [3] 張馳, 顧徽瑜, 陸玲. 曲霉高效基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 菌物學(xué)報(bào), 2018, 37(10): 1349-1356.