本文關(guān)鍵詞：細(xì)菌鑒定、菌種鑒定、細(xì)菌基因鑒定、分子鑒定、細(xì)菌16S鑒定、微生物檢測、微生物鑒定
隨著醫(yī)療水平的提升，社會對藥品安全的重視度與需求度顯著增加。我國早在1953年版藥典中就收入了無菌檢查方法，經(jīng)歷數(shù)次修訂，2010版中國藥典不僅完善了無菌檢查的方法，還將無菌檢查的藥品范圍擴(kuò)大到所有眼用制劑和燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的外用劑型，這對藥品微生物污染的風(fēng)險管控和提高我國藥品質(zhì)量起到了巨大推動作用。同時，這也極大的提高了制藥企業(yè)對生產(chǎn)環(huán)境微生物控制的要求。
不僅僅在成品的無菌檢查中，在對生產(chǎn)環(huán)境中的微生物進(jìn)行管控的過程中，除了計數(shù)和特定菌種的控制之外，對部分菌種進(jìn)行適當(dāng)水平的鑒定也是必不可少的環(huán)節(jié)。
傳統(tǒng)生化鑒定雖然對設(shè)備的依賴較少，且單次檢測成本較低；但是對微生物分類的精度較低，鑒定的準(zhǔn)確度很大程度上依賴于鑒定人員的經(jīng)驗。且檢測的指標(biāo)依賴于目標(biāo)菌在鑒定時的生長狀態(tài)，除非能得到比較精確的種屬信息，否則歷史鑒定數(shù)據(jù)很難被用于溯源調(diào)查。
隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，對細(xì)菌進(jìn)行基因型鑒定的方法應(yīng)用也逐漸從科研實驗室擴(kuò)展醫(yī)藥生產(chǎn)型企業(yè)。在2015版藥典中更是大大強化了通過溯源調(diào)查以基因型鑒定為主，表型鑒定為輔的概念。
細(xì)菌基因型鑒定是指通過檢測和比對細(xì)菌16S rDNA基因序列對目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行的菌種鑒定的方法。
在1965年，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的核糖體RNA具有保守性和可變性；1985年開始有人通過核糖體序列計算來分析物種進(jìn)化關(guān)系；在2000年，伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊正式引入基因序列（包括16s rDNA序列等Marker基因）作為細(xì)菌分類標(biāo)準(zhǔn)。
16S rDNA 是所有的細(xì)菌都具有的基因序列，長度適中(在1500~1600bp)，進(jìn)化上具有良好的時鐘性質(zhì)，結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，能很好體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能輕松利用測序技術(shù)得到其序列，故被細(xì)菌學(xué)家和分類學(xué)家普遍認(rèn)可，素有“細(xì)菌化石”之稱。
16S rDNA序列由9個可變區(qū)和10個保守區(qū)（下圖一）構(gòu)成。
圖一：16S rDNA序列結(jié)構(gòu)圖
保守區(qū)序列反映了物種間的親緣關(guān)系，可變區(qū)序列則能體現(xiàn)物種間的差異。通過在保守區(qū)設(shè)計引物，利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增出高變區(qū)序列，然后通過一代測序技術(shù)得到高變區(qū)序列信息，再將其與數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)存在的菌種對應(yīng)區(qū)間的序列信息進(jìn)行比對分析，來進(jìn)行菌種鑒定。
一般情況下，在細(xì)菌的分類學(xué)中，普遍的共識是序列相似度在97%以上的，可以認(rèn)為目標(biāo)菌種與數(shù)據(jù)庫序列所屬的菌種為同一個屬；序列相似度在99%以上的，可以認(rèn)為目標(biāo)菌種與數(shù)據(jù)庫序列所屬的菌種為同一個種。
相比與傳統(tǒng)生理生化鑒定，分子型鑒定具有許多優(yōu)勢：
①可檢測范圍更廣：即使無法通過培養(yǎng)得到純菌落，只要能夠提取得到微量的16S rDNA就可以通過分子生物學(xué)的方法進(jìn)行測序鑒定。
②鑒定結(jié)果重復(fù)性更好：細(xì)菌的DNA序列在通常情況下都是穩(wěn)定的，不會應(yīng)為菌群的生長周期而發(fā)生變化。因此，在菌群生長的任何時期進(jìn)行基因型鑒定，得到的結(jié)果都是一致的。（即便是死菌，只要DNA未被降解也可以進(jìn)行鑒定）。
③鑒定結(jié)果一致性高：序列比對通過特定的算法由計算機(jī)自動分析生成，不向傳統(tǒng)生化鑒定方法一樣需要人工對結(jié)果進(jìn)行判讀。
④鑒定結(jié)果數(shù)字化，方便存儲和溯源調(diào)查：基因型鑒定得到的是堿基排布序列信息，在進(jìn)行溯源調(diào)查或者室間比對時，可以通過直接比對序列相似度來判斷兩個樣本是否為同一個菌種，并不依賴其在物種鑒定時所得到的種屬信息。
⑤鑒定數(shù)據(jù)庫鑒定范圍更廣：與傳統(tǒng)生化方法相比，細(xì)菌基因型鑒定的數(shù)據(jù)庫所收錄的菌種數(shù)量更多（為生化鑒定數(shù)據(jù)庫的5~10倍）。同時，隨著研究的進(jìn)一步深入，每年都有大量新的菌種基因信息被收錄進(jìn)數(shù)據(jù)庫中。浙江天科自主建設(shè)的微生物基因型鑒定數(shù)據(jù)庫到目前為止已經(jīng)收錄了12000多種細(xì)菌的基因型信息，并且依然在不斷的進(jìn)行升級。
16SrDNA菌種鑒定技術(shù)流程如下：
