本文關(guān)鍵詞：真菌鑒定、菌種鑒定、真菌基因鑒定、分子鑒定、真菌ITS鑒定、微生物檢測、微生物鑒定
在過去的十年中，隨著醫(yī)藥制造業(yè)的快速增長，相關(guān)產(chǎn)品發(fā)生真菌污染的事件也在增加，在2012年美國FDA發(fā)出的45個召回中有7個涉及霉菌或酵母污染；2013年-2015年也發(fā)生5起因真菌污染而導(dǎo)致的召回事件。在2012年發(fā)生的在醋酸甲基強(qiáng)的松龍注射液中的真菌污染事件中奪去了48人的生命……
但這并非個例，類似爆發(fā)的真菌感染，如腦膜炎、角膜炎等常見諸報端。2006年美國疾病控制和預(yù)防中心（CDC）的一項(xiàng)調(diào)查報告顯示因真菌性角膜炎的發(fā)病率增加，從而導(dǎo)致博士倫大規(guī)模召回產(chǎn)品，并為此花費(fèi)了近2.5億美元的賠償。
任何類型的真菌污染無疑都是需要深入追溯的，因此擁有對真菌到種水平的鑒定手段至關(guān)重要，它可以為調(diào)查溯源提供強(qiáng)有力的佐證。由于室內(nèi)空氣、水、人員和材料都可能是藥廠發(fā)生真菌污染的來源，因此基于潛在的風(fēng)險考慮，目前CGMP要求醫(yī)藥產(chǎn)品的生產(chǎn)必須通過嚴(yán)格的生產(chǎn)過程控制以保證質(zhì)量，所以建立環(huán)境監(jiān)測程序（EM）是無菌藥品生產(chǎn)過程中最重要的組成部分之一，當(dāng)然這同時也適合非無菌產(chǎn)品的生產(chǎn)過程。
為了很好的把握環(huán)境中微生物的變化趨勢，許多生產(chǎn)商會選擇對環(huán)境采集到的所有微生物進(jìn)行鑒定，通過識別和定量微生物來衡量生產(chǎn)設(shè)備和生產(chǎn)環(huán)境的狀態(tài)。多數(shù)情況下，在生產(chǎn)環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌通常能鑒定到種水平，但真菌鑒定，特別是霉菌鑒定目前還沒有一個類似細(xì)菌鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。這主要是由于現(xiàn)有的常規(guī)方法在鑒定真菌到種的水平能力還是有限的。
傳統(tǒng)的真菌鑒定和其限制因素
真菌是一類特殊的真核微生物，大約有十萬余種。在潔凈室造成污染的真菌主要為霉菌和酵母兩種。鑒定方法上，基于表型鑒定方法由于相對較低的成本，被大量實(shí)驗(yàn)室廣泛地使用，但這往往需要有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員才能勝任，比如對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件的選擇等；此外表型鑒定還受到參考數(shù)據(jù)庫的大小和類型的限制，這些數(shù)據(jù)庫多是面向臨床診斷而不是工業(yè)應(yīng)用，所以基于這類數(shù)據(jù)庫的鑒定結(jié)果往往存在一定的偏差。準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果對發(fā)現(xiàn)污染菌超標(biāo)和溯源十分重要，錯誤的鑒定結(jié)果往往導(dǎo)致后續(xù)的消殺治理等工作并沒有效果。近年來，分子生物學(xué)的發(fā)展，為真菌的準(zhǔn)確鑒定提供了新的可靠的技術(shù)手段和鑒定渠道。
基因型鑒定
核糖體DNA序列用于生物分類已經(jīng)使用了很多年。最近核糖體基因也已被用于對真菌進(jìn)行親緣關(guān)系的鑒定。雖然分類學(xué)家早已使用該技術(shù)進(jìn)行真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析、分類和重新分類，但是直接用于制藥生產(chǎn)環(huán)境的真菌鑒定最近才開始得到普及，這主要是由于近期才有完整的檢測產(chǎn)品或者第三方檢測實(shí)驗(yàn)室為藥企提供鑒定。如AB公司開發(fā)的MicroSEQ數(shù)據(jù)庫，是一個基于DNA測序結(jié)果比對而進(jìn)行微生物鑒定的產(chǎn)品，其初步提高了真菌鑒定質(zhì)量，為相關(guān)企業(yè)鑒定提供了新的解決方案。
相比基于表型信息的鑒定結(jié)果，基因測序提供的數(shù)據(jù)具有更準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，這已被業(yè)界普遍認(rèn)可和接受。美國食品和藥物管理局（FDA）在2004年更新的指導(dǎo)文件中引入了遺傳方法，在美國食品藥品管理局“FDA無菌生產(chǎn)指南（FDA Guidance for Industry. Sterile Drug Products Produced by AsepticProcessing – Current Good Manufacturing Practice）”文件中，F(xiàn)DA強(qiáng)調(diào)在進(jìn)行環(huán)境微生物監(jiān)測方面，相比傳統(tǒng)的生化和表型的技術(shù)，基因型的鑒定方法已經(jīng)被證實(shí)具有更準(zhǔn)確和更精確的優(yōu)勢，特別是在無菌測試、模擬灌裝污染等的調(diào)查中具有重要的價值。cFDA于2015年12月1日開始實(shí)施的2015版藥典中，在“9204 微生物鑒定指導(dǎo)原則”、“9205 藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測和控制指導(dǎo)原則”中也建議對受控環(huán)境收集到的微生物進(jìn)行適當(dāng)水平的鑒定，微生物菌群信息有助于預(yù)期常見菌群，同時也強(qiáng)化了通過測序進(jìn)行基因型鑒定的概念。
現(xiàn)有的鑒定系統(tǒng)的局限性
盡管有了科學(xué)界和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的支持和認(rèn)可，但專家們也一致認(rèn)為現(xiàn)有的商業(yè)識別系統(tǒng)仍有提高和改善的空間，包括其鑒定準(zhǔn)確性和鑒定范圍。首先，商業(yè)數(shù)據(jù)庫中已知真菌的種類，它不應(yīng)該僅僅體現(xiàn)在數(shù)量上，還應(yīng)該體現(xiàn)出其生物特性，比如大多數(shù)據(jù)庫都是基于臨床的病原微生物，但對于藥廠所關(guān)心的環(huán)境微生物的數(shù)據(jù)收集卻很少，這樣的數(shù)據(jù)庫其實(shí)對于藥企真菌鑒定來說價值并不大。其次，商業(yè)軟件選擇了特定的基因序列構(gòu)建DNA數(shù)據(jù)庫，這導(dǎo)致它只會基于該序列的信息進(jìn)行鑒定，這同樣也會影響到它的應(yīng)用。
D2基因作為鑒定序列的局限性
在MicroSEQ系統(tǒng)里主要應(yīng)用核糖體的大亞基的延伸序列D2作為檢測對象。在大多情況下，它可以較好的將未知的真菌鑒定到屬、科等水平，但是由于相近的真菌有非常相似的D2序列，此種情況下檢測D2區(qū)域就達(dá)不到很好的區(qū)分效果了。舉例來說，一些黑曲霉的株（Aspergillus niger）被重新分類為黑麴菌（Aspergillusbrasiliensis），其中最有代表性的是黑曲霉16404株（Aspergillus niger 16404）被重新分類為黑麴菌。但是幾乎所有的表型試驗(yàn)和D2基因測序，都不能區(qū)分這兩個種。由于缺乏形態(tài)學(xué)的多樣性、不穩(wěn)定的表型特征以及培養(yǎng)條件對表型的影響，表型很難用于區(qū)分不同的黑曲霉。另一方面，D2序列在所有的Aspergillus niger和Aspergillus brasiliensis種內(nèi)都是一致的，因此也不能用于這兩個種的區(qū)分。
D2序列在Aspergillus niger和Aspergillus brasiliensis兩個種間不具備鑒定的能力
基于ITS2基因測序的優(yōu)點(diǎn)
為了解決D2基因測序鑒定的局限性，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)核糖體操縱子中的ITS序列可更好的被應(yīng)用于真菌的系統(tǒng)鑒定。在真菌的核糖體操縱子中有兩個ITS區(qū)域。ITS1位于18S和5.8S之間，ITS2位于5.8S和28S之間。整個rRNA操縱子一起轉(zhuǎn)錄，但轉(zhuǎn)錄后的rRNA，兩個不具備功能的ITS被剪切掉。ITS序列作為一個間隔序列十分重要，但同時它又不具備功能，因此，它的突變速度會大于5.8S、18S和28S基因。這少量的突變提升，使得ITS的序列相比D2具備更好的多態(tài)性。因此，將ITS1-5.8S-ITS2整個測序有助于真菌分類。但是對于常規(guī)鑒定目的時，我所經(jīng)過長期的實(shí)踐和國際的研究團(tuán)隊(duì)均發(fā)現(xiàn)ITS2單獨(dú)使用，通常足夠用于真菌鑒定。
舉例如將A. niger和A. Brasiliensis的ITS1-5.8S-ITS2進(jìn)行全長測序后發(fā)現(xiàn)兩個種之間有5個堿基的差別，而只用ITS2進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)有1個堿基的差別，但是這一個堿基的差別十分穩(wěn)定，因此足以用來區(qū)分這兩個種。
圖：ITS2序列可以區(qū)分Aspergillus niger和Aspergillus brasiliensis兩個種
對ITS2參考數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)展
影響鑒定的準(zhǔn)確性不僅取決于用于識別的基因序列，而且還受制于鑒定所用到的數(shù)據(jù)庫。獲得最相關(guān)的、準(zhǔn)確的和兼容的微生物庫是實(shí)現(xiàn)正確的微生物鑒定的關(guān)鍵。 我所專注于微生物研究，很早就意識到只依賴于商業(yè)數(shù)據(jù)庫是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因此我們建立了制造環(huán)境中遇到的最全面的細(xì)菌和真菌的序列數(shù)據(jù)庫，這使我們能夠提供最高質(zhì)量的鑒定結(jié)果。通過不斷的維護(hù)和更新ExPharmDB，從而盡可能的確保我們的細(xì)菌和真菌數(shù)據(jù)庫可以覆蓋用戶的需求。